前言：　　 近年来,随着早产儿管理技术和治疗手段的发展,极低和超低出生体重儿的存活率有了明显改善。但随之而来,因肺组织尚未发育成熟,加上吸入高浓度氧气,机械通气,感染等因素影响,使得早产儿支气管肺发育不良(broncho pulmonary dysplasia,BPD)的发病率在逐年上升。由于目前缺乏有效的监控手段及治疗方法,重患多于生后1年内死亡,即使幸存者,儿童早期呼吸系统疾病的高患病率,以及远期神经发育障碍也严重影响了患儿的生活质量。　　 研究表明炎症反应在BPD发生、发展中发挥了重要作用。由于炎症反应增加了肺泡-毛细血管通透性,大量白蛋白和其它血清蛋白渗出,使得肺水肿成为BPD早期的主要病理表现之一。　　 大量体内研究证实,阿米洛利(amiloride)敏感性上皮钠通道(epithelialsodiumchannel.ENaC)是钠离子从项膜进入极化上皮细胞的主要通道,以对Na+有高度选择性和对亚微摩尔量的阿米洛利敏感为特征,在呼吸道上皮主要由三个同源亚基α,β和γ组成,与肺内液体清除密切相关,而Ⅱ型肺泡上皮(alveolarepithelialtypeⅡ.ATⅡ)细胞是实现钠水重吸收的主要功能细胞。以往研究表明ENaC功能障碍不仅与多种病理情况下肺水肿的发生有关,而且决定了肺水肿的预后。然而,有关BPD早期ENaC表达和功能的研究较少,且结论还不明确。　　 因此,本研究采用经典的高氧致新生大鼠BPD模型,利用real-timePCR和westernblot方法观察α-,β-和γ-ENaC亚基mRNA和蛋白表达的动态变化,并同时原代培养新生大鼠的ATⅡ细胞,利用膜片钳技术和流式细胞技术,记录暴露高氧中的ATⅡ细胞阿米洛利敏感性钠电流和阿米洛利敏感性体积变化,以确定高氧暴露下ENaC表达变化与其功能的相关性。　　 方法：　　 一、高氧暴露下新生大鼠肺组织ENaC表达检测　　 1、BPD动物模型制备、分组与标本采集:　　 将自然分娩的新生Wistar大鼠,随机分为高氧组和对照组,每组32只。高氧组于生后12小时内放入氧箱中,使箱内FiO2=0.85,CO2＜0.5%,湿度60～70%,温度21～25℃。每天定时与对照组间交换母鼠。对照组以同样护理条件置于空气中。每组分别于高氧暴露后1、3、5和7天随机选取8只鼠,取肺待检。　　 2、Real-timePCR技术检测肺组织α-,β-和γ-ENaCmRNA表达:　　 利用总RNA提取试剂盒提取样本总RNA,利用TIANScriptRTKit反转录合成cDNA,ExicyclerTM96荧光定量仪和SYBRGREEN进行荧光定量分析,利用2△△CT法计算ENaCmRNA相对表达量。　　 3、Westernblot技术检测肺组织α-,β-和γ-ENaC蛋白表达:　　 蛋白提取并定量,应用8%凝胶进行SDS-PAGE分离,将蛋白转至PVDF膜,用TBS配置5%脱脂奶粉封闭PVDF膜,一抗4℃过夜,二抗37℃孵育1小时。应用ECL试剂盒发光,分析图像。　　 二、高氧暴露下新生大鼠ATⅡ细胞ENaC表达检测　　 1、新生大鼠ATⅡ细胞的分离、纯化及鉴定:　　 出生24小时内的Wistar大鼠,无菌取肺,采用胰酶和胶原酶联合消化分离细胞,应用差速贴壁和免疫粘附法纯化细胞,分别于21%02～85%02培养箱内进行原代培养。应用SP-C免疫荧光染色及透射电镜进行细胞鉴定。分别于高氧暴露后1、2和3天收集细胞。　　 2、Real-timePCR技术检测ATⅡ细胞中α-,β和γ-ENaCmRNA表达:　　 方法同一、2　　 3、Westernblot技术检测ATⅡ细胞中α-,β-和γ-ENaC蛋白表达:方法同一、3　　 三、高氧暴露下新生大鼠ATⅡ细胞ENaC钠水转运功能检测　　 1、新生大鼠ATⅡ细胞的分离、纯化与培养:　　 同二、1　　 2、膜片钳技术记录全细胞阿米洛利敏感性钠电流:将长有ATⅡ细胞的玻片从培养基中取出,浸入倒置相差显微镜的浴槽中。应用Multiclamp700B膜片钳放大器进行系列阻抗和电容补偿。记录全细胞电流时保持电位-40mV,应用-120到+80mV,步阶20mV的电位进行电流电压曲线分析。滤波频率为1kHz,采样频率为2kHz。　　 3、流式细胞技术检测阿米洛利敏感性细胞体积变化:记录高氧组与对照组加入和未加入阿米洛利细胞的前向角散射光(FSC)的峰值道数,并计算两者的差值。　　 四、统计分析　　 所有数据以均值士标准差表示。采用独立样本T检验进行相同时间点组间比较,采用单因素方差分析和LSD法t检验进行组内各时间点两两比较。以P＜0.05作为差别有统计学意义的标准。　　 结果：　　 一、高氧暴露下新生大鼠肺组织ENaC表达　　 1、肺组织中α-ENaC表达:　　 α-ENaCmRNA表达在高氧暴露1天与对照组比较无显著差别,高氧暴露3、5和7天与对照组比较显著升高(P＜0.01),且随高氧时间延长表达量逐渐增加。α-ENaC蛋白表达在高氧暴露1、3和7天与对照组比较没有显著差别,而高氧暴露5天与对照组比较表达显著增加(P＜0.05)。高氧暴露5天比高氧暴露3天表达量显著增加(P＜0.01)。　　 2、肺组织中β-ENaC表达:　　 β-ENaCmRNA表达在高氧暴露1、3、5和7天均显著高于对照组(P＜0.01),且高氧1、3和5天随高氧暴露时间延长表达量逐渐增加(P＜0.01),而高氧5天与高氧7天比较无显著性差别。　　 β-ENaC蛋白表达在各个时间点与对照组比较均显著增加(1和3天P＜0.05,5和7天P＜0.01),且高氧组和对照组均有随时间延长表达增加的趋势,生后5天和7天显著高于生后1天和3天(P＜0.01)。　　 3、肺组织中γ-ENaC表达:　　 γ-ENaCmRNA表达在高氧暴露1天和3天显著高于对照组(P＜0.01),且高氧3、5和7天随高氧暴露时间延长表达量逐渐减低,而高氧1天和高氧3天以及高氧5天和7天比较无显著差别。　　 γ-ENaC蛋白表达在高氧暴露l天与对照组比较显著增加(P＜0.01),而3、5和7天与对照组的差别没有统计学显著性。高氧3天蛋白表达显著低于高氧1天(P＜0.01)。　　 二、高氧暴露下新生大鼠ATⅡ细胞ENaC表达　　 1、ATⅡ细胞鉴定结果:形态学特征:立方形或多角形,聚集生长呈铺路石样,胞浆内可见分泌颗粒。SP-C免疫荧光鉴定:ATⅡ细胞胞浆内可见绿色荧光,纯度均大于85%。透射电镜鉴定:可见ATⅡ细胞表面微绒毛和特征性的同心圆状板层小体。　　 2、ATⅡ细胞中α-ENaC表达:α-ENaCmRNA表达在高氧暴露1天、2天和3天与正常对照组比较均无显著差别,而高氧暴露2天和3天显著高于高氧暴露1天(P＜0.05)。α-ENaC蛋白表达在高氧1天和2天低于正常对照组(P＜0.05),高氧3天与正常对照组无显著差别。　　 3、ATⅡ细胞中β-ENaC表达:　　 β-ENaCmRNA和蛋白表达在高氧1、2和3天均显著高于正常对照组(mRNA水平P＜0.01,蛋白水平P＜0.05),且表达量随高氧暴露时间延长有增加的趋势,高氧2天和3天β-ENaC表达量显著高于高氧1天(P＜0.01),而高氧2天与高氧3天间无显著差别。　　 4、ATⅡ细胞中γ-ENaC表达:γ-ENaCmRNA表达在高氧1、2和3天均显著高于正常对照组(1天P＜0.05,2和3天P＜0.01),且γ-ENaCmRNA表达量在高氧3天内有先增加后降低的趋势即高氧2天显著高于高氧1和3天。　　 γ-ENaC蛋白表达在高氧1、2和3天均显著增加。γ-ENaC蛋白表达量随高氧暴露时间延长有增加的趋势,高氧2天和3天显著高于1天(P＜0.05),高氧2天和3天之间没有显著差别。　　 三、高氧暴露下新生大鼠ATⅡ细胞ENaC钠水转运功能　　 1、ATⅡ细胞全细胞钠电流的变化:　　 高氧暴露细胞比正常对照组细胞有更高的基础钠电流和阿米洛利敏感性钠电流。高氧1天阿米洛利敏感性钠电流比正常对照组增大,但没有统计学显著性(P＞0.05)。高氧2天阿米洛利敏感性钠电流比正常对照组显著增大(P＜0.05)。高氧2天与高氧1天相比,基础钠电流没有改变,但阿米洛利敏感性钠电流显著增大(P＜0.05)。在基础钠电流中近1/4是阿米洛利敏感性电流而大部分是阿米洛利非敏感性电流。　　 2、ATⅡ细胞阿米洛利敏感性体积变化:　　 向细胞悬液中加入阿米洛利后细胞体积缩小,高氧暴露显著增加了阿米洛利敏感性体积变化(P＜0.01),且高氧暴露2天和3天该体积变化大于高氧暴露1天(P＜0.01),而高氧2天和3天间无显著差别。　　 结论：　　 在高氧BPD早期的肺水肿阶段,肺组织中ENaC三个主要亚基(α、β和γ)并未出现表达减低的变化,反而α-ENaC在mRNA水平、β-ENaC在mRNA和蛋白水平均表现出随高氧时间延长表达逐渐增加的趋势。β-ENaC高表达可能是高氧早期肺组织的一个显著特点。　　 高氧暴露早期对新生大鼠ATⅡ细胞α-ENaC蛋白表达表现为抑制作用,而对α-ENaCmRNA表达无明显影响。高氧暴露对新生大鼠ATⅡ细胞中β和γ-ENaC的影响,无论在mRNA水平还是蛋白水平均表现为促进作用。但是在高氧初期对α-ENaC蛋白表达表现出短暂的抑制作用,继之恢复正常。　　 高氧暴露早期虽然出现了肺水肿改变,但ATⅡ细胞顶膜钠转运功能没有被抑制,反而代偿增强。结合细胞ENaC表达的研究结果推测,β-和γ-ENaC是高氧后引起钠转运增强的主要亚基。高氧同时促进了阿米洛利敏感性和非敏感性钠转运,说明高氧不仅促进了ENaC的功能,对其他钠转运体的功能也有促进作用。可见,钠转运障碍并非高氧BPD早期肺水肿的主要原因。