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研究目的:在许多实体肿瘤中,对表面标志物的表达以及倍体分析的技术(SET-iFISH检测技术)已被证实成为检测循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)的敏感性很高的方法,而在乳腺癌特别是原发性乳腺癌中的相关研究甚少。因此我们通过SET-iFISH检测技术来检测原发性乳腺癌中的CTCs,并通过细胞角蛋白(cytokeratin,CK)以及倍体的表达情况来得出CTCs亚型的特征,从而分析乳腺癌中的CTCs及其相关特性,以期为乳腺肿瘤的早期监测、肿瘤分子分型、疗效评价、预后指导、肿瘤风险评估、个体化治疗等一系列过程提供更为精确有力的检测手段。研究方法:在2014.02至2015.06间,我们入组了长海医院甲乳外科184例原发性乳腺癌患者,26例乳房良性肿瘤患者及10例健康志愿者。在该研究中分别抽取以上患者及健康志愿者的未经任何治疗的外周血样本。所有项目均可提供知情同意书,该试验经过长海医院伦理委员会审核通过且根据赫尔辛基宣言的原则进行。该试验参考了相关临床试验以及制造商的说明(Cytelligen,San Diego,CA,USA)。首先,用ACD抗凝管(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA)采集7.5ml患者血样本,然后与3ml hCTC分离介质充分混匀,在室温下用450×g进行离心5分钟。免疫磁性微粒偶联抗白细胞单克隆抗体包括抗CD45抗体后缓慢振荡10分钟并提取上层清液并培养。随后用一种磁性分离技术(Promega,Madison,WI)去除白细胞,在室温下磁性颗粒以500×g缓慢离心2分钟。细胞颗粒在细胞固定剂中彻底重悬并覆盖于CTC表面而后被应用到后续iFISH的分析。对于CK-iFISH方法,样本由Alexa Fluor594-共轭单克隆抗CD45和Alexa Fluor488-共轭抗Pan CK(CK4、5、6、8、10、13及18)或抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)的联合抗体在黑暗中联合免疫标记1小时,使用FISH技术S500 Stat Spin Thermo Brite Slide杂交/变性系统(Abbott Molecular,Des Plaines,IL,USA)的8号染色体着丝粒探针8(CEP-8)Spectrum Orange(Vysis,Abbott Laboratories,Abbott Park,IL,USA),非整倍体上DAPI+/CD45-/Pan CK+/-/HER2+者被认为是CTCs。采用SPSS19.0(IBM,NY,USA)的软件进行统计学处理。采用U检验对乳腺癌,乳房良性疾病及健康志愿者之间CTCs数量的不同进行分析。包含或不包含CK表达的CTCs阳性率由Fisher’s精确检验进行统计。应用Origin Pro 8 SR0 8.0版(Northampton,MA,USA)进行图表生成。所有的检测数据均采用双侧检验,且认为P值小于0.05有统计学意义(P<0.05)。研究结果:1.CTCs与乳腺癌在2014.02至2015.06间,总共入组了上海市长海医院甲乳外科184例原发乳腺癌患者,26例乳房良性肿瘤患者及10例健康志愿者。184例乳腺癌患者中167例可检测到非整倍体CTCs(90.76%),其中CTC的数量为0-19/7.5ml血(均值2)。检测出的CTC总数为676,其中三倍体的数量为387(57.25%),来源于147例患者(147/167,79.89%)。而其中仅18例患者(18/167,10.78%)中的33个CTC被检出CK+(4.88%)。26例良性肿瘤中8例(30.77%)可检测出非整倍体CTC,明显少于乳腺癌患者(P=0)。此外,良性肿瘤中CTC的检出率均<3/7.5ml血。而健康志愿者的血样本中均未检测出CTC。2.CTCs与肿瘤大小在184例被检测的乳腺癌样本中,158例的肿瘤大小可测量。其中根据肿瘤直径的最大径来看,80例≤2cm(归为T1期),68例>2 cm且≤5cm(归为T2期),而10例>5cm(归入T3期)。尽管T3期的患者所占比例少,但其在组间CTC的检出率最多(0-18,均值5.5)。三倍体CTC的数量在T3期和T1/T2期患者中明显不同,均值分别为4、1.5和1(P=0.048,P=0.006)。基于CK表达不同的CTC亚型在T1、T2及T3期患者中无显著差异。3.CTCs与乳腺癌分子分型在184例乳腺癌样本中,166例的激素受体状态已知。其中根据乳腺癌分子分型来看,30例属于Luminal A型(ER+和/或PR+,且HER2-,且Ki-67<14%=,89例为Luminal B型(ER+和/或PR+,且HER2+;ER+和/或PR+,且HER2-,且Ki-67≥14%),35例HER2阳性型(ER-且PR-且HER2+),以及12例三阴性(ER-且PR-且HER2-)。发现存在CTCs的人数中,Luminal A型占30例中的28例(80%),数值范围为0-18/7.5ml血(均值2),Luminal B型的患者中占89例的80例(89.9%),数值范围为0-19/7.5ml血(均值2),而在HER2阳性型患者中占35例中的34例(97.1%),数值范围为0-15/7.5ml血(均值4),另外三阴性患者12例均发现CTCs的存在(100%),数值范围在0-12/7.5ml血(均值2.5)。HER2阳性型和三阴性的乳腺癌患者与Luminal A型和Luminal B型者相比,检测到CTCs的频率及数量均相对较高。CTCs亚型基于染色体核型,包括三倍体,四倍体及其他多倍体(≥5),能在不同激素受体状态的乳腺癌中体现类似的分布。而CK+的CTCs主要存在于Luminal A和Luminal B的患者中。研究结论:SET-iFISH系统可用于检测非转移性的不依赖CK表达的乳腺癌CTCs。CTCs存在与否及其数量与乳腺癌的肿瘤大小以及激素受体状态密切相关。而在不考虑肿瘤大小以及激素受体状态影响的情况下,所有的乳腺癌患者可检测到的CTCs绝大部分为三倍体型。此外,由于EMT的存在,CK+的CTCs仅占极少数且其比例也很低。可以明确的是,HER2阳性和三阴性的患者CTCs的CK表达极少,这支持了ER和PR表达的缺失会促进EMT的发生和肿瘤的侵袭力这一观点。