研究总体思路：HTK (Histidine-tryptophane-ketoglutarate)液是1975年由德国Bretschneider等研制的一种仿细胞内液的晶体液,目前仍广泛用作肝、肾、心脏、肺和胰腺等移植供体的保存液,也可用作心脏手术中的停搏液或经肺动脉灌注的肺保护液。作为心脏停搏液,HTK液有单次灌注、作用时间长、不影响手术操作、减少预充血量等优点,对成年瓣膜置换、主动脉手术等病人可提供与冷含血停搏液相似的心肌保护作用。两项Meta分析的结果显示,含血停搏液改善术后早期心功能,但晶体停搏液有利于改善患者长期预后。对儿科病人心脏手术中的心肌保护,国内外不同心脏中心选择的停搏液种类和成分有差异,含血停搏液是否优于晶体停搏液仍是有争议的问题。国际上对HTK液在小儿心脏手术中的应用报道很少。有研究观察了HTK液用于30例新生儿大动脉转位矫治术中的心肌保护,术后24h内血清TnI水平≤3mg/ml,但缺乏对照组病例。另有研究发现189例采用HTK液的新生儿术中血钠波动明显,显著血钠下降(血钠下降>15mmol/L)的发生与患儿术后癫痫发作有关。最近有研究回顾分析218例行大动脉调转(Arterial switch operation, ASO)手术的新生儿,其中30例采用冷HTK液,188例采用温血停搏液,在进行病例匹配和排除高危因素影响后,HTK液组患儿术后血清心肌酶的浓度明显高于温血停搏液组,但30天死亡率无差别。本课题组曾回顾分析HTK液和改良St.Thomas液在118例婴幼儿心脏手术中的应用,发现前者有更高的自动复跳率和更低的死亡率,HTK液用于阻断时间在105-242min的小儿复杂先心病手术是安全、可行的。国内其它中心也有HTK液对婴幼儿心肌保护作用优于St.Thomas液的报道。迄今为止,没有前瞻性随机对照试验评价HTK液和含血停搏液对未成熟心肌保护的作用优劣,尤其HTK液用于长时间心脏停跳(阻断时间在75min以上)的安全性尚无随机对照研究评价。近年来随着低龄、复杂、重症先心病手术患儿比例的上升,对阻断时间较长的未成熟心脏采用何种停搏液能达到更好的保护效果成为我们面临的重要问题。目前国内无儿童和婴幼儿专用的心脏停搏液,阜外医院小儿心脏外科中心率先在复杂先心病矫治或根治术中常规采用HTK液进行心肌保护,有效减少了预充血量和异体血用量,前期临床资料的总结显示,HTK液有良好的心肌保护效果和安全性,但它是否是未成熟心肌保护最适宜的停搏液仍有待深入研究,本课题围绕HTK液及改良HTK液对长时间缺血心肌的保护作用开展基础和临床研究。第一部分模拟临床上婴幼儿CPB心脏手术过程,建立乳猪深低温低流量CPB模型,麻醉和体外循环管理方法,包括麻醉用药、预充成分、预充量、血气管理、停跳液灌注方法、改良超滤等均与临床相似,主动脉阻断时间为2h,停机后2h为实验终点。利用酶联免疫吸附法、免疫组化、光镜、电镜等技术手段对血清、冠脉、心肌组织标本进行检测,从心肌代谢、组织学、细胞形态学等不同层面探讨HTK液和含血停搏液对在体未成熟心肌的保护作用差异,以期为临床上停搏液的选择提供实验依据。第二部分基于近年来对先心病手术后死亡婴儿的心肌病理检测发现氧化损伤是最主要的损伤类型以及HTK液相对于含血停搏液存在抗氧化能力的不足,我们提出假设：在HTK液中添加靶向线粒体的抗氧化剂依布硒啉,可能通过减轻氧化应激使心肌线粒体得到保护,从而更好地保护未成熟心肌。与第一部分实验方法相同,建立乳猪深低温低流量CPB模型,主动脉阻断2h,停机后2h取心肌组织标本,利用电镜、比色法、免疫组化、Western blot (WB)、RT-PCR等技术对心肌组织进行检测,探讨含依布硒啉HTK液对在体缺血再灌注未成熟心肌的保护作用机制,以期为含依布硒啉HTK液的临床应用提供科学依据。第三部分对HTK液在小儿复杂先心病手术中的应用进行了临床观察,同时进行了大样本病例回顾分析,重点探讨HTK液对术中心脏传导阻滞、血钠浓度和血浆渗透压的影响及其与临床预后的相关性。第一部分HTK液和含血停搏液对在体缺血再灌注未成熟心肌保护作用的对比研究背景与目的对长时间缺血的未成熟心肌采用何种停搏液能达到更好的保护效果仍是有争议的,目前也无随机对照试验评价HTK液和含血停搏液对未成熟心肌保护作用的优劣。本研究拟在模拟临床情况的乳猪深低温低流量CPB模型上,探讨HTK液和冷含血停搏液对在体未成熟心肌的保护作用差异。方法15只健康乳猪,2周龄,体重4.5-6.8kg,随机分为对照组(Con组,n=5)、HTK液组(HTK组,n=5)、冷含血停搏液组(含1：1氧合血,CBC组,n=5)。所有动物经升主动脉、上、下腔静脉插管建立CPB模型,HTK组和CBC组降温至鼻咽温30℃,阻断升主动脉,降温至鼻咽温25℃,低流量CPB,主动脉阻断2h后开放,复温至直肠温35℃以上停机。术中监测血流动力学指标、体温、血气变化,阻断前、开放后分别取冠状静脉窦血测定血氧、乳酸含量,CPB前、停机后2h分别采颈内静脉血测定血清cTnT、cTnI、CK-MB含量。停机后2h取冠脉血管和左室心肌标本,分别检测组织匀浆eNOS、VEGF和iNOS、TNF-α、IL-1β、ATP含量；TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡情况,HE染色光镜下观察组织病理损伤情况,透射电镜观察心肌细胞超微结构改变和线粒体损伤情况。结果主动脉开放后HTK组正常心律恢复时间较CBC组明显延长(p<0.01),血钠水平较CBC组明显降低(p<0.05),但HTK组异体血用量较CBC组明显减少(p<0.01)。开放后动脉和冠状静脉窦血氧、乳酸含量差在HTK组和CBC组间均无显著差异(p>0.05)。停机后2h,血清cTnT、cTnI、 CK-MB含量在三组间比较无显著差异(p>0.05),冠脉血管eNOS、VEGF和心肌组织iNOS、TNF-α、IL-1β含量在三组间比较也无明显差异(p>0.05)。HTK组心肌组织病理损伤评分与CBC组无显著差异(p>0.05),但HTK组TUNEL阳性细胞数较CBC组明显增多(p=0.037),电镜下线粒体损伤评分HTK组明显高于对照组和CBC组(p=0.01和p=0.045)；HTK组心肌组织ATP酶含量较对照组明显降低(p=0.017)。结论1、与1：1冷氧合血停搏液相比,HTK液在心肌代谢、心肌损伤标记物的释放、冠脉内皮激活和早期炎性反应、组织病理学损伤方面均无明显差异,但TUNEL标记的心肌细胞凋亡增多,细胞超微结构的改变显示线粒体损伤更重,心肌ATP酶含量有减少趋势,提示HTK液对阻断时间在2h的未成熟心脏,其心肌保护作用处于临界状态。2、HTK液明显减少体外循环预充血量和异体血使用量,从节约血源和减少异体血输入的意义上而言,对阻断时间在2h以下的未成熟心脏,HTK液可以作为含血停搏液的良好替代品。3、HTK液的使用要注意正常心律恢复延迟和引起低钠血症的问题。第二部分含依布硒啉HTK液对在体未成熟心肌缺血再灌注损伤的保护作用背景与目的改良HTK液对未成熟心肌能否有更好的保护作用尚无报道。与含血停搏液相比,HTK液存在抗氧化能力不足,依布硒啉(Ebselen)是目前公认具有模拟谷胱甘肽氧化酶作用最好的药物之一,能在体内发挥线粒体靶向的抗氧化功效,添加Ebselen的HTK液对在体未成熟心肌缺血再灌注损伤是否具有保护作用尚不清楚。本研究利用乳猪深低温低流量CPB模型,探讨含依布硒啉HTK液对在体未成熟心肌的保护效果及可能的作用机制。方法15只健康乳猪,2周龄,体重4.5-6.1kg,随机分为对照组(Con组,n=5)、HTK液组(HTK组,n=5)、HTK+E液组(含lOnMEbselen, HTK+E组,n=5)。全部动物经升主动脉、上、下腔静脉插管建立CPB模型,HTK和HTK+E组降温至鼻咽温30℃,阻断升主动脉,降温至鼻咽温25℃,低流量CPB,主动脉阻断2h后开放,复温至直肠温35℃以上停机。术中监测血流动力学指标、体温、血气变化。停机后2h取左室心肌标本,检测组织匀浆MDA、SOD、Mn-SOD、ATP含量；TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况；透射电镜观察心肌细胞超微结构改变和线粒体损伤情况；WB检测心肌线粒体细胞色素C、Bax、Bcl-2蛋白的表达,并检测心肌组织HSP72蛋白的表达,RT-PCR检测心肌组织HSP72mRNA的表达。结果血流动力学、体温、血气变化在HTK+E组和HTK组间比较无显著差异(p>0.05),两组的异体血用量也无明显差异(p>0.05)。与对照组比较,停机后2hHTK组心肌组织ATP酶含量明显降低(p=0.011), MDA含量明显升高(p=0.038)；与HTK组比较,HTK+E组SOD和Mn-SOD含量均明显升高(p=0.021和p=0.020),TUNEL阳性细胞数明显减少(p=0.045),心肌线粒体细胞色素C的释放明显减少(p=0.010)。HTK组Bcl-2/Bax比值较对照组明显升高(p=0.028),但HTK+E组与对照组无显著差异(p>0.05)。HTK+E组HSP72蛋白和mRNA的表达明显高于HTK组(p=0.039和p=0.035),HSP72蛋白和Mn-SOD的表达量有显著正相关关系(r=O.581,p=0.023)。电镜下HTK+E组线粒体损伤评分明显低于HTK组(p=0.047)。结论1、含依布硒啉的HTK液能较HTK液减轻心肌的氧化应激,更好地保护心肌线粒体结构,减少心肌细胞色素C的释放,防止早期凋亡信号事件发生,并能诱导未成熟心肌HSP72蛋白表达,增强心肌的抗氧化损伤能力,从而减少心肌细胞凋亡。2、含依布硒啉的HTK液心肌保护作用优于HTK液,在预充血量和异体血用量上与HTK液相同,可以较HTK液更好地替代含血停搏液,有潜在的临床应用价值。第三部分HTK液对小儿复杂先心病手术中心律、血钠的影响及其与临床预后的关系研究背景与目的成人心脏手术中应用HTK液后引起开放后心脏传导阻滞并增加室颤发生率,HTK液引起的血钠波动与新生儿心脏手术后癫痫有关也有报道,但HTK液对小儿先心病手术中心律、血钠和血浆渗透压变化的影响尚无文献报道。本研究观察应用HTK液后心律(率)恢复情况及其与临床预后的关系,同时对病例进行回顾分析,探讨HTK液引起的术中血钠、血浆渗透压的变化对术后脑并发症是否有影响。方法第一组病例：2012年6月-12月,有169例先心病患儿在CPB下行择期复杂心脏畸形矫治或根治术,采用HTK液作为心脏停搏液,观察主动脉开放后心脏复苏情况,记录心脏传导阻滞发生情况和正常心律(率)恢复时间,与围术期有关因素作相关性分析,并分析术后使用起搏器的影响因素。第二组病例：2012年2月-12月,有322例先心病矫治或根治手术患儿术中采用HTK液作为心脏停搏液,记录围术期血钠、血浆渗透压变化情况,以年龄、性别、体重、手术类型、术中预充量、HTK灌注量、复跳后是否室颤、是否有区域性脑灌注、脑灌注时间、最低鼻咽温、CPB时间、主动脉阻断时间、血钠变化>15mmol/L、最高血钠、最低血钠、最高血Glu、最低血Glu、术后是否带起搏器、24h累积胸液量、呼吸机支持时间、ICU停留时间作为影响因素,分析术后出现脑并发症(烦躁/躁动、抽搐)的危险因素。结果第一组病例：>3岁患儿开放后心脏传导阻滞和室颤的发生率均明显高于≤3岁患儿(57.1%vs.34.7%, p=0.045;78.6%vs.95.1%, p=0.037);在≤3岁患儿中,正常心律(率)恢复时间与患儿术前心胸比正相关(r=0.274,p=0.010),与ACC、CPB时间正相关(r=0.183, p=0.045; r=0.205, p=0.025),与开放时鼻咽温负相关(r=-0.189,p=0.038),与术后24h米力农用量、ICU停留时间正相关(r=0.187,p=0.041; r=0.214, p=0.019).二元Logistic回归分析显示,正常心律(率)恢复时间和心脏传导阻滞均不是术后使用起搏器的影响因素。但在某些手术类型(TAPVC矫治、主动脉弓离断矫治、主肺动脉窗修补、肺动脉起源异常矫治、TECD矫治等手术)患儿中,发生心脏传导阻滞者ICU停留时间明显延长(p=0.021)。第二组病例：术中发生低钠血症有220例(71.9%),其中≤125mmol/L为13例(4.2%),≤130mmol/L为55例(18%),<135mmol/L为152例(49.7%)。>3岁患儿严重低钠的发生率明显高于≤3岁患儿(p=0.001)。与转机前比较,主动脉阻断后早期血钠即明显下降(p=0.000),转流期间血钠呈偏低状态,停机后有215例(70.3%)恢复至正常血钠水平。入PICU和术后12h血钠均显著高于转机前水平(p=0.000),术后12h血钠>146mmol/L有119例(38.9%),其中≥150mmol/L有31例(10.1%)。血浆渗透压的变化与血钠基本一致,但转流前、转流期间和停机后血浆渗透压均低于正常值水平,入PICU后逐渐恢复至正常值范围。术后癫痫发作有3例(0.9%),无明显原因的烦躁/躁动有55例(18%),二元Logistic回归分析显示,术后12h血钠值是患儿出现脑并发症的危险因素。ROC曲线分析显示,术后12h血钠值在瓣膜成形、TECD矫治、DORV矫治、肺动脉闭锁根治等手术患儿中预测脑并发症的发生有一定价值。结论1、>3岁患儿心脏自动复跳率低于≤3岁患儿；≤3y患儿中,心/胸比大、阻断时间和CPB时间长、开放时鼻咽温低的患儿心律(率)恢复时间易延长,并与术后早期米力农用量增加、ICU停留时间延长有一定相关性,但是否有因果关系还需进一步研究。提示在手术操作允许的情况下,提早复温,提高开放温度,有利于患儿术后早期恢复。2、HTK液引起的心脏传导阻滞和心律(率)恢复时间延长均不是术后使用起搏器的影响因素,但在某些手术类型(如TAPVC矫治、主动脉弓离断矫治、肺动脉起源异常矫治、TECD矫治等手术)的患儿,发生心脏传导阻滞者ICU停留时间明显延长,HTK液是否为这部分患儿ICU时间延长的独立风险因素有待进一步研究。3、HTK液引起不同程度的低钠血症,可加重血浆低渗状态,>3岁患儿严重低钠血症的发生率高于≤3岁患儿,积极预防可以减少严重低钠的发生。术后早期的高钠血症是患儿术后癫痫发作、烦躁/躁动发生的独立风险因素,术后12h血钠值在瓣膜成形、TECD矫治等手术患儿中预测脑并发症的发生有一定价值。