研究目的:热应激严重影响奶牛的生产和健康,是制约奶业持续发展的重要因素。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传调控机制,与动物的热应激反应密切相关,但其参与奶牛热应激反应的分子机制仍不清楚。本研究旨在通过全基因组重亚硫酸盐测序法（WGBS）分析热应激期（夏季）和非应激期（春季）奶牛基因组DNA甲基化状态的差异,获得特异的差异甲基化区域,筛选相关的关键基因,为奶牛热应激的DNA甲基化研究积累数据,为选育耐热奶牛提供潜在的靶基因和表观遗传标记。研究方法与内容:本研究以中国荷斯坦牛的春夏季血液DNA样本构建文库和进行WGBS检测。通过对测序数据进行质控、基因组比对、甲基化位点提取等过程获得奶牛全基因组的甲基化状态,采用生物信息学分析策略筛选奶牛热应激相关的差异甲基化区域（DMR）和基因。随后,与课题组转录组测序的差异表达基因（DEG）进行联合分析,筛选潜在的热应激下启动子差异甲基化与差异表达负相关的关键基因。随后选择GNAS和DNLZ基因,利用重亚硫酸转化法（BSP）和RT-q PCR,在春夏24头奶牛个体和39℃热处理不同时间（24 h、48 h和72 h）的牛乳腺上皮细胞（Mac-T）中检测基因启动子DNA甲基化水平和转录表达的差异。最后,通过PGL3-GNAS和PGL3-DNLZ启动子荧光素酶报告基因载体构建、体外甲基化处理以及荧光素酶报告基因细胞转染实验,验证GNAS和DNLZ基因启动子DNA甲基化与基因表达的关系。研究结果:（1）构建了中国荷斯坦牛血液基因组DNA全基因组甲基化图谱,发现奶牛全基因组约4%的C位点处于甲基化状态,C的甲基化类型包含m Cp G、m CHH和m CHG三种。其中m Cp G类型为主,占比达90%以上。在夏季热应激和春季非应激个体间共检测出49861个DMRs（FDR＜0.05）,注释到7613个差异甲基化相关基因（DMG）中。其中,4069个DMGs的启动子区有DMRs,这些基因参与生热作用、活性氧代谢、氧化磷酸化等生命活动。（2）将DMR位于启动子区的4069个基因与来自相同个体的转录组测序的DEGs联合分析,发现了264个启动子的差异甲基化且差异表达基因（DMEG）,其中有157个基因的启动子甲基化水平与基因表达负相关。根据表达水平变化最显著或甲基化显著性最高或参与应激过程,选择GNAS、DNLZ、SMAD5基因作为奶牛热应激相关的DNA甲基化候选靶基因。（3）奶牛个体和细胞中热应激后GNAS和DNLZ基因启动子区的甲基化水平显著上调（P＜0.05）,夏季奶牛个体和热处理48 h的细胞中基因GNAS和DNLZ表达水平显著降低（P＜0.05）,甲基化转移酶和甲基结合蛋白2转录水平显著增加（P＜0.05）,GNAS和DNLZ基因启动子荧光素酶报告质粒体外甲基化可以直接抑制其转录活性,说明启动子高甲基化负调控报告基因的表达。GNAS和DNLZ基因可作为奶牛热应激相关的表观遗传标记。研究结论:（1）奶牛全基因组约4%的C位点处于甲基化状态,C的甲基化类型包括m Cp G、m CHH和m CHG三种。其中,m Cp G类型为主,占比90%以上;（2）热应激会引起奶牛个体基因组DNA甲基化状态的改变,在夏季个体与春季个体间共检测到7613个DMGs;（3）热应激会引起奶牛GNAS和DNLZ基因的启动子甲基化水平显著增加,启动子高甲基化可抑制两个基因的转录表达。