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人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator, t-PA)具有高效、特异的溶血栓作用,是目前防治血栓性疾病最有效的药物之一。apo-B100是极低密度值蛋白(very low density lipoprotein,VLDLy)组装前体和正确组装的必需载脂蛋白。VLDLy是以完整的脂蛋白颗粒通过卵母细胞膜上的凹陷小泡以内吞的形式进入生长中的卵泡,实现有机物在卵黄中的沉积。为探索t-PA在鸡卵黄中积淀的可行性,开发具有抗心血管疾病的功能性鸡蛋,本研究将t-PA功能区基因片段△t-PA与鸡VLDLy组装前体apo-B100进行融合,构建特异性表达载体并转染体外培养的肝细胞,确证融合基因表达框架正确后,采用脂质体介导法转染到鸡体,对融合蛋白在鸡体内的表达及其在卵黄的沉积进行定量、定性、定位的研究,为进一步利用家禽作为生物反应器生产t-PA奠定基础。本研究应用分子生物学技术,提取高产蛋鸡肝脏总RNA,利用设计的一对特异引物,RT-PCR法克隆apo-B100基因片段,通过蛋白linker与t-PA功能区片段△t-PA融合,并定向克隆到pCDNA3表达载体CMV启动子下游,构建pCDNA3-apo-△tPA表达载体,经鉴定基因读码框架正确后,转染体外培养鸡胚肝细胞,ELISA检测融合蛋白表达水平,发色底物法检测表达产物生物学活性。将pCDNA3-apo-△tPA表达载体用脂质体包裹后,分3次经翅下静脉注入鸡体内,每次间隔2d,收集不同时间生产的鸡蛋,SDS蛋白电泳和Western bloting检测表达产物;ELISA法检测表达水平;发色底物法检测表达产物生物学活性;免疫组化法检测pCDNA3-apo-△tPA在鸡体不同的组织器官的表达和分布情况。结果显示,应用RT-PCR克隆的apo-B100基因片段,长1479bp;apo-B100介导的t-PA融合基因在体外培养的鸡胚肝细胞中能够表达并分泌到细胞外,在48h表达水平最高,达675.3ng/106细胞/24h,表达产物活性为135.8IU/106细胞/24h;卵黄蛋白SDS蛋白电泳和Western bloting检测表明,在约84×10~3KDa处有一条目的蛋白条带;融合蛋白在质粒注射后第3w表达水平最高,为7.8mg/L,此后呈现缓慢下降的趋势,至第9w,表达量仍可维持1.8mg/L;活性检测表明,体内和体外培养的细胞表达的融合蛋白均有生物学活性;通过对心脏、肝脏、血管、输卵管、肌肉、肾脏、等不同的组织免疫组化检测,发现融合蛋白在肝脏、肌细胞分布较多。apo-B100介导的t-PA融合基因在鸡体内的成功表达,表明1479bp的apo-B100介导的外源基因表达产物能够透过卵黄膜实现在卵黄中的沉积,证明了外源基因表达产物在卵黄中积淀这一途径的可行性。这一途径有望使鸡蛋成为预防心血管疾病的功能性食品,使鸡体成为药物蛋白开发生产的重要资源。