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目的 免疫毒素(Immunotoxins,IT)又称为生物导弹,是由单克隆抗体连接一定量的细胞毒素(Cytotoxin,CTX)制成的一种免疫复合物,是一类能定向攻击靶细胞的药物。本实验研究制备曲妥珠单克隆抗体(Trastuzumab,T,商品名为赫赛汀)与南瓜蛋白(Cucurmosin,CUS)的偶联物即免疫毒素(T-CUS),旨在充分利用前者的靶向、选择性强和后者活性高的特点,消除前者疗效偏低和后者副作用偏大等缺陷;检测制备的免疫毒素对靶细胞的免疫活性和体外杀伤作用,寻求新的治疗HER-2阳性乳腺癌的方法。方法 1免疫毒素的制备:先后使用SPDP、2-IT作为交联剂,用化学交联法制备两种免疫毒素即T-CUS-PDP和T-CUS-2-IT。2免疫毒素的纯化:用Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析和Sp-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱进行纯化,并用SDS-PAGE进行电泳鉴定,用BCA法进行定量。3免疫毒素结合活性测定:用细胞ELISA法检测T-CUS-PDP、T-CUS-2-IT对靶细胞的结合活性。4用SRB法比较CUS、CUS-PDP、CUS-2-IT对乳腺癌细胞BT-474和HCC1937的体外杀伤作用。5用SRB法比较T、T-PDP的高浓度组和低浓度组分别对乳腺癌细胞BT-474和HCC1937的体外杀伤作用。6用SRB法比较CUS、T、T-CUS-PDP、T-CUS-2-IT及CUS与T联合对乳腺癌细胞BT-474和HCC1937的体外杀伤作用。结果 1用SPDP、2-IT作为交联剂通过化学交联法制备的免疫毒素经Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析和Sp-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱纯化后通过SDS-PAGE鉴定,在抗体上方有出现较明显的免疫毒素的条带,免疫毒素T-CUS-PDP、T-CUS-2-IT制备成功。2制备的两种免疫毒素与单纯曲妥珠单抗相比,与BT-474细胞的结合活性没有明显变化,能保持原有免疫活性。3 CUS用SPDP交联后,对BT-474细胞的IC50从0.325μg/ml升至1.736μg/ml,活性损失了80%左右;对HCC1937细胞的IC50从0.298μg/ml升至0.904μg/ml,活性损失了70%左右;实验换用2-IT作为交联剂后,对BT-474细胞的IC50从0.325μg/ml升至0.365μg/ml,对HCC1937细胞的IC50从0.298μg/ml升至0.316μg/ml,活性均保留了约90%。4曲妥珠单抗用SPDP交联后,仍保留了对BT-474细胞的大部分活性。T对BT-474细胞的IC50为0.124μg/ml,T-PDP对BT-474细胞的IC50为0.143μg/ml,T-PDP仍保留了抗体大部分的活性。另外不管是低浓度组还是高浓度组,T和T-PDP对HCC1937细胞都没有明显的杀伤作用,在实验所设浓度下达不到半数抑制作用。5免疫毒素T-CUS-PDP对BT-474细胞的IC50为0.011μg/ml,按质量浓度计算,比CUS高了约30倍,比T高了约10倍;T-CUS-2-IT对BT-474细胞的IC50为0.008μg/ml,比CUS高了约40倍,比T高了约16倍。CUS与T两者联合用药实验结果表明,免疫毒素对BT-474细胞的作用不是T与CUS两种药物单独作用的简单加和,曲妥珠单抗连接CUS可以显著提高对乳腺癌BT-474细胞的杀伤力。免疫毒素T-CUS-PDP和T-CUS-2-IT在实验所设的相同的浓度梯度范围内,对HCC1937细胞没有明显的杀伤作用。结论 1用SPDP、2-IT作为交联剂可成功构建由T和CUS结合而成的免疫毒素。2免疫毒素的纯化不是一个很简单的过程,免疫毒素彻底分离纯化的方法须在今后的研究中不断探寻。3 T-CUS-PDP,T-CUS-2-IT的免疫活性与偶联前比无明显差异,能够保持原有活性。4用SPDP交联的CUS比用2-IT交联的CUS活性下降明显,但用两者与T制备的免疫毒素对BT-474细胞的活性均有显著提高,且用2-IT交联得到T-CUS-2-IT活性提高更多。本研究为探寻新的治疗HER-2阳性乳腺癌的方法提供了参考。