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第一部分:KEN通过ADAM10 5’UTR促进ADAM10的翻译目的:探究小分子药物KEN处理数种细胞后其ADAM10蛋白表达的变化并探究其作用机制。方法:1.利用WB技术,观察药物KEN及其结构类似物Alsterpaullone和同为CDK/GSK3抑制剂的AT7519处理细胞后,其ADAM10蛋白表达的变化。2.药物KEN分别处理数种类型的细胞后,利用WB技术检测细胞ADAM10蛋白水平的变化。3.SH-SY5Y细胞经小分子药物KEN的时间梯度和浓度梯度的处理后WB技术探究其最合适的作用时间和浓度。4.SH-SY5Y细胞在适宜浓度和时间的KEN作用下,免疫荧光技术检测其与对照组相比的ADAM10蛋白表达强度。5.CCK-8试剂盒检测不同浓度的KEN对SH-SY5Y细胞活性的影响。6.WB技术探究KEN对SHSY5Y-APP细胞APP蛋白及分泌型蛋白s APPα表达的作用。7.ELISA实验探究SHSY5Y-APP细胞在KEN处理后,其分泌的细胞外Aβ1-42在处理组和对照组之间的差异。8.使用q-PCR技术探究KEN对SH-SY5Y细胞的m RNA表达是否有影响。9.使用转录抑制剂Act D、翻译抑制剂CHX、蛋白酶体抑制剂MG132、溶酶体抑制剂CQ和翻译起始因子复合物竞争性抑制剂4EGI-1作用于细胞,WB技术观察其是否能阻断KEN对ADAM10的表达促进作用。10.将CDK5和GSK3β的si RNA转染到细胞中,WB技术观察其是否能阻断KEN对ADAM10的表达促进作用。11.将包含或不包含5’UTR片段的ADAM10质粒转染到细胞中,WB技术观察KEN的有效作用片段。12.将包含有ADAM10启动子和5’UTR片段的序列克隆到PGL4.17的荧光素酶报告基因质粒中,然后将各个片段的质粒转染到细胞中,与对照组（Ctrl）相比,观察各处理组的荧光素强度。结果:1.SH-SY5Y细胞在不同浓度的三种试剂（KEN、Alsterpaullone、AT7519）作用下,只有KEN与对照组相比明显增加了细胞ADAM10蛋白的表达（**P＜0.01）。2.SH-SY5Y细胞在KEN的时间梯度（0-48小时）作用下,处理36小时的条件下细胞ADAM10蛋白表达增加最明显（**P＜0.01）。3.人源性的HEK-293细胞、小鼠的传代海马神经元HT22、小鼠的原代神经元在不同浓度（0-2.0μM）的KEN作用下,细胞的ADAM10蛋白表达增加（**P＜0.01）。4.免疫荧光观察到的结果同WB:SH-SY5Y细胞在恰当的时间和浓度的KEN作用下ADAM10蛋白表达增加（**P＜0.01）。5.不同浓度的KEN（0-2.0μM）对细胞活性的影响无统计学意义。6.SHSY5Y-APP细胞在750 n M的KEN作用36小时后与对照组（Ctrl）相比,分泌型蛋白s APPα明显增加（**P＜0.01）,而APP蛋白表达变化无统计学意义。7.SHSY5Y-APP细胞在750 n M的KEN作用36小时后与对照组（Ctrl）相比,其分泌的Aβ1-42明显减少（*P＜0.05）。8.SH-SY5Y细胞在750 n M的KEN作用36小时后,其ADAM10m RNA水平和对照组相比无明显变化（P＞0.05）。9.有效浓度的翻译抑制剂CHX和翻译起始因子复合物竞争性抑制剂4EGI-1作用于细胞后,可以阻断KEN对ADAM10的蛋白表达促进作用。10.敲低CDK5和GSK3β后,不影响KEN对细胞ADAM10的蛋白表达促进作用。11.KEN促进包含5’UTR片段细胞的ADAM10蛋白表达（**P＜0.01）,而对不含有5’UTR片段的细胞没有影响。结论:1.KEN可以促进多种细胞的ADAM10蛋白表达。2.SH-SY5Y细胞在750 n M的KEN作用36小时的条件下,ADAM10蛋白增加最明显。3.有效浓度的KEN对细胞活性几乎无影响。4.SH-SY5Y细胞在750 n M的KEN作用36小时后,WB检测其培养基中的分泌型蛋白s APPα明显增加。5.KEN在转录后水平以依赖5’UTR的方式对ADAM10的蛋白表达进行调控。第二部分:SHMT2具有RBP的功能并参与KEN对ADAM10翻译的调控目的:探究ADAM10 5’UTR的RNA结合蛋白（RBP）,并观察SHMT2作为RBP是否参与KEN对ADAM1O的调控。方法:1.RNA pulldown实验结合质谱分析检测SH-SY5Y细胞在KEN作用下,其ADAM10 5’UTR的RNA结合蛋白,并与对照组进行比较。2.蛋白印迹WB实验验证洗脱下来的5’UTR RBP。3.利用STRING database探究RBP的相互作用关系。4.将ADAM10的5’UTR切割成不同的序列片段,采用RNA EMSA技术探究SHMT2与5’UTR的结合基序。5.RNA immunoprecipitation（RIP）结合q-PCR实验探究SHSY5Y细胞在KEN作用下与对照组相比,SHMT2-5’UTR结合量的差异。6.RIP-seq结合生物信息学方法探究SHMT2在KEN处理后与对照组（Ctrl）相比,其共有和差异结合的RNA的KEGG及GO富集分析特点。7.SH-SY5Y-APP细胞在750 n M的KEN作用36小时后,用RNA-seq技术分析其转录组基因与对照组比较得到差异表达基因（DEGs）。8.RNA-seq结合生物信息学方法得到DEGs的KEGG和GO富集分析特点。9.STRING database探究DEGs的相互作用关系。10.WB检测SH-SY5Y细胞在750 n M的KEN作用36小时后,其SHMT2的蛋白表达。11.利用生物信息学的方法将RNA-seq得到的DEGs和RIP-seq得到的差异表达基因进行分析。12.将细胞的SHMT2基因敲低,WB方法检测其可否阻断KEN对ADAM10的促进表达作用。结果:1.通过RNA pulldown结合质谱分析得到ADAM10 5’UTR的RNA结合蛋白,通过WB实验验证了洗脱下来的部分RBP,并通过STRING database得到RBP的相互作用关系。2.通过人和鼠源的RNA EMSA实验观察纯化的SHMT2蛋白直接与ADAM10 5’UTR结合。3.RIP结合q PCR实验发现在KEN作用下,SHMT2与5’UTR的结合减少（**P＜0.01）。4.RIP-seq结合生物信息学方法得到KEN处理组和Ctrl对照组中与SHMT2结合的共有和差异基因。其共有基因分析显示参与AD和神经退行性疾病等的KEGG通路,并在参与形成甲基转移酶复合物和起到Tau蛋白结合功能等环节上起作用。其差异基因显示参与碳代谢等KEGG通路。5.RNA-seq结合生物信息学方法得到SH-SY5Y-APP细胞在KEN处理下与对照组相比的转录组差异表达基因（DEGs）,其KEGG结果显示一碳代谢等通路表达上调。6.STRING database得到转录组上调的DEGs的相互作用关系,这些有相互作用的DEGs主要参与一碳代谢。7.SH-SY5Y细胞在KEN的浓度梯度（0-2μM）下作用36小时,其SHMT2蛋白表达增加（*P＜0.05）。8.将RNA-seq的DEGs和RIP-seq的差异表达基因一起进行分析,得到112个重叠基因,将其按生物信息学方法进行GO富集分析,得到这些基因参与的主要的分子功能、生物过程、细胞成分。9.将细胞的SHMT2敲低后,ADAM10的基础表达量降低且阻碍了KEN对ADAM10的表达促进作用。结论:SHMT2通过识别GAGGG/GAAAG基序而与ADAM10的5’UTR直接结合（见于人和小鼠对应的蛋白和核酸）,SHMT2参与小分子KEN对ADAM10蛋白表达的调控。第三部分:KEN在动物模型中通过调控ADAM10而改善AD病理和行为学目的:进一步探究KEN在AD模型鼠APP/PS1中的作用。方法:1.取相同数量的雌性10月龄APP/PS1和同窝野生型（WT）小鼠,将APP/PS1和WT小鼠随机分为两组,分别是WT-生理盐水组、WTKEN组、APP/PS1-生理盐水组、APP/PS1-KEN组。利用一次性注射器对小鼠腹腔注射对应等量液体,KEN的注射量为5 mg/kg/2天（KEN在生理盐水中充分溶解混匀。）2.提取在KEN处理下的HT22细胞的蛋白,利用RNA pulldown结合蛋白印迹WB（实验步骤同第二部分）与对照组相比,探究小鼠的SHMT2与5’UTR的结合。3.小鼠打药完毕后,对其进行水迷宫和场景恐惧实验,探究KEN对小鼠空间记忆能力的影响。4.小鼠行为学实验完毕后,提取其脑组织分别制作脑组织石蜡切片和脑组织蛋白提取液,并用免疫组化IHC和蛋白印迹WB检测相关指标。结果:1.750 n M的KEN作用HT22细胞36小时后,提取细胞蛋白进行小鼠ADAM10 5’UTR的RNA pulldown结合蛋白印迹实验,发现KEN作用后与对照组（Ctrl）相比,SHMT2与5’UTR的结合减少。2.蛋白印迹WB实验观察到Nr CAM、APP在各组老鼠脑组织中无明显变化;SHMT2、ADAM10在加药组（WT-KEN、APP/PS1-KEN）较对照组相比表达都增加（**P＜0.01）;s APPα在APP/PS1小鼠组别中,打药组较对照组的表达增加（**P＜0.01）;过度磷酸化的Tau蛋白,在加药组与对照组相比表达下降（**P＜0.01）。3.免疫组化IHC实验发现在APP/PS1小鼠中,加药组（APP/PS1-KEN）较对照组相比（APP/PS1）,老年斑数量明显减少（**P＜0.01）。4.ELISA实验观察到,APP/PS1小鼠中,加药组（APP/PS1-KEN）较对照组相比（APP/PS1）,其可溶与不可溶性Aβ1-40/1-42表达均下降（**P＜0.01）。5.水迷宫行为学实验发现,APP/PS1小鼠中,加药组（APP/PS1-KEN）较对照组相比（APP/PS1）,逃避潜伏期明显缩短（*P＜0.05）;在目的象限的停留时间增加（*P＜0.05）;穿越平台的次数增加（*P＜0.05）。6.场景恐惧实验发现,APP/PS1小鼠中,加药组（APP/PS1-KEN）较对照组相比（APP/PS1）,平均凝滞次数和平均凝滞时间都表现增加（*P＜0.05）。结论:在体实验表明,KEN可以改善AD模型鼠APP/PS1的病理改变和空间记忆能力。