我们的试验设想来自于对细胞中的一种膜蛋白(caveolin-1)、细胞多药耐药性以及细胞的胞内钙调控之间的关系的思考。三者看似没有太多关联，但是我们的试验发现，它们之间有着较直接的关系。 1.Caveolin-1与细胞多药耐药性的关系。多药耐药(MDR)是肿瘤病人化疗失败的重要原因。MDR的产生经常是由于癌细胞中过表达MDR1基因编码的P-glycoprotein(P-gp)形成的。它是ABC(ATP-bindingcassette)转运超家族中的一类。它能水解ATP将细胞内的药物泵到细胞外，导致了细胞内药物浓度降低，使癌细胞产生了耐药性。 Caveolae是细胞膜上面的为50-100nm的细胞膜“平滑”的凹陷，它富集有胆固醇和鞘脂。Caveolin-1是一种21kDa的跨膜蛋白，是caveolae中的主要的结构蛋白。Caveolin-1能通过与许多蛋白相互作用调控信号传导。 现在对于caveolin蛋白和细胞多药耐药的关系的报道是相互矛盾的。一方面，在一些耐药细胞中，caveolin表达水平上升；但是在另外一些耐药细胞中，虽然P-gp的表达水平很高，但是caveolin-1和-2却检测不到，即是说caveolin的表达与P-gp蛋白的表达并不相关。我们组以前的研究发现，caveolin-1与P-gp相互作用，并且能抑制其功能，使得耐药细胞的耐药性下降。因此我们试图进一步确定caveolin-1影响细胞多药耐药性的机制。这与通常认为的caveolin-1和P-gp呈正相关的观点正好相反。 为了确认我们过去报道的caveolin-1和P-gp呈负相关的结果的可靠性。我们不仅在蛋白水平，还进一步在mRNA水平上找到了证据。我们在耐药的乳腺癌细胞Hs578T/Dox细胞中过表达caveolin-1，筛选到高表达caveolin-1的单克隆细胞。Western-blot试验显示其表达量高于对照6倍以上。同时从westernblot和confocal结果清楚显示，P-gp蛋白基本消失。更为惊奇的是，通过RT-PCR和NorthernBlot试验，过表达细胞中并未发现P-gp的mRNA。我们也检测了细胞的耐药性和P-gp蛋白转运活性，发现过表达细胞耐药性下降明显，基本和敏感株细胞一样。这样，我们可以看出，细胞中高表达caveolin-1能在转录水平抑制P-gp的表达，从而降低细胞的多药耐药性。 2.Caveolin-1与细胞内钙稳态平衡之间的关系。细胞质钙离子浓度对每个细胞来说都是一个非常重要的信号，它可以调节许许多多的细胞生理活动。真核细胞可以通过下面两种方式调节胞质钙离子浓度：释放细胞内的钙库或胞外的钙进入细胞。非兴奋性细胞膜上存在两种类型的钙通道：1.非钙库调控通道，这些通道可以被磷酸肌醇二磷酸(PIP2)水解，如DAG活化；2.钙库调控通道(SOCs)，它能被钙离子从胞内钙库清空而激活。人们发现，钙库调控的钙离子通道分布很广，在从酵母到人的所有真核细胞中都有。因此，它对细胞内钙稳态平衡非常重要。 研究发现，胞外钙离子只会从某些特定的细胞膜微区涌入细胞，而这些微区正好是caveolae。另外，当细胞内钙库清空后，钙离子必须重新注满钙库，以维持胞内钙的稳态平衡。这时，内质网膜靠近细胞膜，细胞膜上的钙通道开放钙离子涌入细胞，涌入的钙被ER膜上的钙离子ATP酶泵入ER。而caveolae作为细胞膜上的凹陷，正好可以与ER膜有更近的距离，更利于钙被泵入ER。由此可见，caveolae/caveolin-1在钙库调控的钙离子涌入这个过程中的重要作用。 因此，我们设计了一系列试验来验证caveolin和SOC的关系。我们在Hs578/S细胞中稳定过表达，并且使用SiRNA质粒knock-down细胞中的caveolin-1蛋白。得到caveolin-1表达从高到低的三种细胞。westernblot检测发现过表达细胞的caveolin-1比对照上升6倍以上，knock-down的细胞中的caveolin-1的表达则至少下降80％。用透射电镜观察细胞发现caveolae的数量与caveolin-1呈正相关。然后我们使用单细胞荧光成像技术检测细胞的SOC活性。发现细胞的SOC的活性与caveolin-1的表达量呈正相关，即细胞中表达caveolin-1越多，SOC的活性越高。我们进一步使用MβCD来模拟caveolin表达减少这种情况，发现处理后的过表达和对照细胞株SOC的活性下降，基本和抑制caveolin-1表达的细胞一致。我们也使用了SOC的抑制剂处理细胞，发现SOC的活性基本消失，证明了我们检测到的确实为SOC的信号。上述试验说明caveolin-1作为一种调控分子，可能调节SOC的活性，进一步调节细胞内钙稳态平衡。