基于转录组测序分析的水稻和水稻干尖线虫互作关系研究

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dpf443398
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水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)是一种植物地上部迁移寄生线虫,几乎遍布所有水稻产区,严重时可造成高达50%的经济损失。通过对植物病原线虫侵染的寄主植物进行转录组测序,有利于我们了解植物线虫的寄生机制和植物的应对策略,也有助于对两者之间互作关系进行深入研究。本论文研究了被水稻干尖线虫侵染的水稻的防御反应变化趋势,并对不同侵染时期(接种后1d、3d和7d)的水稻进行转录组测序,在此基础上,筛选克隆的水稻激酶基因Os RLK3,通过酵母双杂交文库进一步筛选到与Os RLK3互作的水稻干尖线虫ATP合成酶基因Ab-atps,并研究和验证了Ab-atps的功能及其与Os RLK3互作关系,主要取得以下结果。(1)水稻接种水稻干尖线虫后,防御反应通路出现显著变化,侵染早期的水杨酸、茉莉酸通路显著上调,乙烯通路显著下调(p<0.05);水稻干尖线虫侵染也导致水稻光合作用通路显著富集并下调,光合作用天线蛋白和光合作用通路被显著抑制;水稻干尖线虫侵染后7 d的水稻注释到与水稻潜根线虫和水稻根结线虫侵染的水稻相同的4个参与水稻光合作用的DEGs;另外,发现被水稻干尖线虫侵染和水稻潜根线虫侵染的水稻在接种后3 d和7 d有一个共同的转录因子基因OS09G0417800(Os WRKY62),该基因在水稻与水稻迁移性线虫互作中可能存在重要作用。(2)发现OS01G0741200(Os RLK3)基因可被flg22、茉莉酸、水杨酸和几丁质诱导表达,几丁质处理水稻0.5 d,Os RLK3基因表达量最高,且表达水平随处理时间延长递减。(3)对OsRLK3基因的基因编码区进行扩增,得到2064 bp的序列,随后构建诱饵载体p GBKT7-Os RLK3,建立水稻干尖线虫酵母双杂交文库;使用酵母双杂交系统进行互作筛选,获得全长为1341 bp的水稻干尖线虫ATP合成酶基因Ab-atps。该基因编码区转入p GADT7载体中,与p GBKT7-Os RLK3进行回转验证,结果为阳性,表明两者之间存在互作关系。(4)Ab-atps基因的功能特征研究表明,该基因定位在水稻干尖线虫的食道以及生殖系统中,在水稻干尖线虫的不同虫态中,Ab-atps在幼虫中表达量最高,其次为卵、雌虫和雄虫。原位杂交结果表明该基因定位在水稻干尖线虫的食道以及生殖系统中,推测该基因可能与线虫生长与繁殖相关。经Ab-atps ds RNA浸泡处理12 h、24 h、36 h和48 h的线虫,Ab-atps的相对表达量与对应的gfp ds RNA浸泡相同时间的处理相比,分别显著下降了86.7%、80.7%、86.3%和75.4%(p<0.05),RNAi处理的沉默效率随着时间延长差异不显著(p>0.05)。Ab-atps被RNAi处理后的线虫的繁殖数量均显著降低(p<0.05)。Ab-atps被RNAi的水稻干尖线虫接种水稻,水稻Os RLK3基因的表达量在接种后0.5d显著降低(p<0.05),接种后1d表达量最高,而对照gfp ds RNA处理在接种后0.5 d最高,随后降低,因此进一步证明了Ab-atps和Os RLK3存在互作关系。Ab-ATPS通过瞬时表达显示其分布于烟草细胞核、细胞质和细胞膜,并导致明显的细胞凋亡和坏死。本研究揭示了水稻被水稻干尖线虫侵染后的防御基因变化和转录表达模式;明确了水稻被水稻干尖线虫侵染后防御反应发生显著变化,证实了水稻对水稻干尖线虫和已报到的迁移性线虫以及稻瘟病的侵染应答机制存在相似性,初步揭示了植物对地上部迁移性植物线虫的防御策略。本研究使用水稻Os RLK3基因构建重组诱饵载体,从水稻干尖线虫酵母双杂交文库中筛选到一个互作基因:水稻干尖线虫ATP合成酶Ab-atps,并获得Ab-atps基因c DNA全长,同时对其功能及其与Os RLK3的互作关系进行了研究和验证。本研究结果为进一步揭示水稻干尖线虫的寄生策略及其与寄主植物的互作机制提供理论依据,为水稻干尖线虫的防治提供了新思路和新靶标;同时对系统研究迁移性寄生线虫的寄生致病机制和全面揭示植物线虫与寄主的互作的机制具有重要意义。
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