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雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)是重要甾体药物中间体,可合成多种甾体药物。目前,AD和ADD的生产主要采用微生物转化法实现。胆固醇氧化酶(Cho M)和3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDD)是分枝杆菌降解甾醇合成AD和ADD代谢途径中的关键酶。本实验室从自然界中筛选到一株转化植物甾醇高产ADD的新金色分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12,并对其植物甾醇代谢过程中的关键酶Cho M和KSDD进行了研究。本论文在此基础上,将Cho M和KSDD在原始菌中强化表达,以提高ADD的产量。(1)利用载体p MF41在M.neoaurum JC-12中分别加强表达Cho M(Cho M1和Cho M2)和KSDD。在M.neoaurum JC-12中Cho M2是主要的胆固醇氧化酶。重组菌M.neoaurum JC-12/p MF41-cho M2的AD和ADD摇瓶发酵产量分别为1.17 g/L和4.98g/L,分别比原始菌提高了27.2%和2.5%;重组菌M.neoaurum JC-12/p MF41-ksdd的AD和ADD摇瓶发酵产量分别为0.59 g/L和5.27 g/L,AD降低了35.9%,ADD提高了8.3%。(2)构建新金色分枝杆菌表达载体并对其进行优化。以tac启动子替换p MF41的启动子p ACE得到载体p MTac。重组菌M.neoaurum JC-12/p MTac-gfp的构建定性证明了p MTac在M.neoaurum JC-12中能够表达蛋白。M.neoaurum JC-12/p MTac-ksdd定量证明p MTac在M.neoaurum JC-12中的表达效果,M.neoaurum JC-12/p MTac-ksdd中KSDD的酶活达到2.41 U/mg,为原始菌的6.53倍。对载体p MTac的启动子的-10区序列进行优化得到载体p MTac-2。M.neoaurum JC-12/p MTac-2-ksdd的KSDD的活性达到5.16U/mg,比原始菌提高了15.12倍。全细胞转化试验中,重组菌M.neoaurum JC-12/p MTac-2-ksdd转化1 g/L AD,14 h时转化率达到82%,为原始菌的10.7倍;重组菌M.neoaurum JC-12/p MTac-2-cho M2转化1 g/L胆固醇,24 h时转化率达到56%,为原始菌的2.1倍。在摇瓶发酵试验中,M.neoaurum JC-12/p MTac-2-ksdd的AD和ADD产量分别为0.12 g/L和6.14 g/L,AD降低了86.9%,ADD提高了26.3%;M.neoaurum JC-12/p MTac-2-cho M2的AD和ADD产量分别为1.43 g/L和5.18 g/L,与原始菌相比分别提高了55.4%和6.7%。(3)将ksdd和cho M2在M.neoaurum JC-12中串联表达。5 L发酵罐中,以20 g/L植物甾醇为底物,重组菌M.neoaurum JC-12/p MTac-ksdd-cho M2的AD和ADD产量分别为0.62 g/L和10.47 g/L,与原始菌相比,AD的产量降低了50%,ADD的产量提高了27.4%。