癫痫是一组由大脑神经元反复异常同步化放电所引起的短暂中枢神经系统功能失常为特征的慢性中枢神经系统疾病。全球有约超过4000万癫痫患者,我国约有600万癫痫患者。大多数的癫痫患者经过一段时间的规范药物治疗后,痫性发作可以得到控制。但是仍有20%-30%的患者药物治疗并不能够减轻发作的频率和强度,被称为难治性癫病。阐明难治性癫痫的发生机制,提高癫痫发作控制率一直是癫痫研究的热点。以往的研究中,离子通道异常、神经递质异常、神经网络重组、信号转导、线粒体功能异常、自身抗体等是癫痫机制研究的重点。近年来大量研究已经表明炎症是癫痫产生和癫痫发作的关键因素之一。细胞因子是介导炎症反应的最基本物质,大量细胞因子与受体结合后通过开放离子通道、激活下游级联反应等方式产生广泛的生物学效应。癫痫发生中小胶质细胞及星形细胞的活化,释放IL-1β、TNFα等促炎细胞因子,随之这些因子触发神经元、胶质细胞、血脑屏障等多处的炎症信号通路,如NF-κB、COX-2、补体系统、TLR信号通路引起广泛的生物学效应。炎性反应及炎症因子参与了神经递质的失衡、突触传递的异常、神经网络的重构、血脑屏障的破坏等过程,最终导致神经元兴奋性增高、癫痫发作阈值降低。目前IL-1β、IL-6、TNFα、HMGB1等因子的作用研究较为深入,发现癫痫发生中新的细胞因子意味着发现了新的治疗靶点,开启新的治疗途径。除了癫痫的发生机制外,难治性癫痫的另一个重要研究方向是癫痫“耐药性”的形成机制。近年来受到肿瘤多药耐药机制的启示,多药转运体在癫痫患者脑内的表达越来越受到关注。P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是其中发挥最主要作用的转运蛋白。大量癫痫动物模型及癫痫患者脑组织的研究表明,P-gp在神经元、内皮细胞、脑实质和血管周围的星形胶质细胞中表达增高,这种过度表达与难治性癫痫的多药耐药性呈正相关。近年来对多药耐药转运蛋白的调控机制的研究提示COX-2可能是调控P-gp合成的关键因素。COX-2催化的前列腺素E2生成及其他下游反应是诸多炎症反应中的关键环节,这提示多药耐药的形成、P-gp的表达与炎症也有密切的关系。我们的前期研究通过脑电分析发现大黄对癫痫具有抑制作用,其机制可能是大黄素抑制突触前兴奋性氨基酸递质的释放直接抑制海马ca1区锥体神经元epsp,降低由于谷氨酸和nmda受体介导的兴奋毒性增高,大黄素可减轻脑水肿、升高sod、na+-k+atp酶活性,降低mda水平,影响多个病理生理通路。大黄素的抗炎作用以被越来越多的研究证实,大黄素对诸多炎症因子、信号通路都有较为明确的作用。这就提示我们大黄素可能对癫痫的耐药有一定作用,其机制可能是通过cox-2等炎症通路实现。本论文分为两个部分,具体如下:第一部分大黄素通过炎症信号通路对癫痫的调控目的:建立海人酸(kainicacid,ka)注射大鼠癫痫模型,并以大黄素进行干预,通过高通量细胞因子蛋白芯片分析正常大鼠、ka致痫大鼠及经大黄素处理的癫痫大鼠海马组织细胞因子的差异表达,分析ka致痫后细胞因子的改变及大黄素的影响,寻找新的分子治疗靶点。方法:大鼠分为正常对照组(c组),模型组(m组),大黄素干预组(t组)。c组为正常大鼠无处理,m、t组大鼠腹腔注射12mg/kg的海人酸,t组大鼠腹腔注射海人酸10分钟后腹腔注射大黄素(200mg/kg)。根据racine评分标准判定癫痫发作级别,大鼠进行脑电图描记。采用he染色及透射电镜对大鼠海马病理学改变进行观察。取大鼠海马组织进行蛋白提取,应用bca法进行蛋白质定量。采用raybio?大鼠l系列抗体芯片i(90)定量检测细胞因子表达情况。结果:ka注射后大鼠表现出癫痫发作症状,脑电图出现丛集性、阵发性发作的棘波、尖波等癫痫样波,大黄素组大鼠表现出现癫痫发作racine分级较模型组降低。he染色示ka注射后8小时,大鼠海马ca3、ca4区神经元开始出现坏死、凋亡、丢失,48小时达到顶峰,此后ca3、ca4区神经元维持稳定,而海马齿状回颗粒层神经元未见明显减少。蛋白芯片结果提示,ka注射后大鼠海马表现出广泛的细胞因子改变,包括促炎细胞因子il-2、il-3、il-4、il-5、il-12、il-13、tgf-β1、tgf-β2等在造模后短期内即出现表达上调,24小时逐渐恢复正常,以及抗炎细胞因子b7-1/cd80、cntf、cntfr、basic-fgf、csk出现表达下调。细胞膜糖蛋白正向调节因子tgf-β1、tgf-β2、rage在ka注射后表达增加,糖蛋白负向调节因子fractalkine表达降低。大黄素能抑制ka腹腔注射导致的促炎因子升高及抗炎因子的下调。结论:大鼠ka癫痫模型具有理想的颞叶癫痫的特征。ka注射后大鼠海马表现出广泛的细胞因子改变,包括促炎细胞因子在造模后短期内即出现表达上调,及抗炎细胞因子表达下调。这些细胞因子都可通过jak-stat通路、pi3k-akt通路、mapk信号通路等信号通路影响cox-2信号通路或被其影响。大黄素能抑制异常癫痫波发放,降低癫痫发作强度,并能抑制ka腹腔注射导致的促炎因子升高及抗炎因子的下调。同时,癫痫后细胞膜糖蛋白正向调节因子表达增加,负向调节因子表达降低。提示大鼠脑组织炎性反应的过程同时伴随着细胞膜糖蛋白的合成被增强。同样,这种糖蛋白合成可以被大黄素抑制。第二部分大黄素对癫痫耐药性的影响机制目的:验证ka点燃的慢性癫痫模型中是否存在p-gp的表达增高,这种高表达能否被大黄素抑制。通过免疫组织化学方法、蛋白定量方法检测大黄素对cox-2及nmda受体的影响,以及三者对p-gp的影响,从而深入探讨大黄素治疗难治性癫痫的分子机制。方法:大鼠分为正常对照组(c组)、模型组(m组)、大黄素治疗组(e组)、苯妥英钠治疗组(p组)、联合治疗组(s组)。m组、e组、p组、s组大鼠每日10时腹腔注射6mg/kg的海人酸,连续注射7天,建立慢性点燃模型。产生5次连续的2级癫痫或4次连续的3级癫痫视为点燃成功,以点燃成功记为第0天。点燃成功后,e组大鼠每日腹腔注射50mg/kg的大黄素注射液,p组大鼠每日给予40mg/kg苯妥英钠灌胃,1次/日。s组每日给予40mg/kg苯妥英钠灌胃,同时腹腔注射50mg/kg的大黄素注射液。于第3、6、9、12天将大鼠断首,将脑组织进行脑毛细血管分离,取毛细血管上悬液与nbd-csa在共聚焦密闭槽内共孵育,应用激光共聚焦显微镜对毛细血管进行观察,毛细血管腔内nbd-csa荧光密度应用软件进行定量分析。应用免疫组织化学方法检测癫痫发生后海马cox-2、p-gp、nmda受体的表达改变及大黄素对其的影响。应用western-blot检测癫痫发生后海马cox-2、p-gp、nmda受体蛋白的定量改变及大黄素对其的影响。在转录水平应用rt-pcr方法检测癫痫发生后海马cox-2、p-gp、nmda受体mrna的定量改变及大黄素对其的影响。结果:随着癫痫时间的延长,大鼠脑毛细血管p-gp的表达会逐渐增高,其荧光强度也随之增加,9天达到峰值,其后开始下降,分别为3d(98.8±17.4)、6d(118.8±14.4)、9d(153.8±6.67)、12d(144.7±5.25)。对照组大鼠海马有极少cox-2蛋白表达,阳性细胞主要分布于齿状回、ca3和ca4区。m组ka反复注射后cox-2阳性细胞数明显增高,主要位于ca3及ca4区,在第3、6、9、12天无明显差异。在p组cox-2阳性细胞数也明显增高,变化规律及阳性单位数与m组无差异。e组及s组ca3及ca4区阳性细胞数较m组明显减少。对照组大鼠海马各部位均有p-gp蛋白表达,均分布于毛细血管内皮细胞。m组ka反复注射后p-gp阳性单位明显增高,分布于海马各区,在第3、6、9、12天无明显差异。在p组p-gp阳性细胞数也明显增高,变化规律及阳性单位数与m组无差异。e组及s组p-gp阳性单位较m组明显减少。对照组大鼠海马各部位均有nmda受体的表达。m组、e组、p组及s组nmda受体阳性单位均明显增高,分布于海马各区,在第3、6、9、12天无明显差异。western-blot蛋白定量结果:cox-2的表达与p-gp的表达趋势相同,m组及p组与c组比较显著升高(p<0.05),m组与p组比较无明显差异(p>0.05),e组及s组较m组下降(p<0.05),与c组无明显差异(p>0.05);nmda受体的表达呈现出m组、c组、p组及s组与c组比较显著升高(p<0.05),之间表达无明显差异(p>0.05)。rt-pcr结果:m组及p组mdr1、cox-2基因的扩增倍数最高,与c、e、s组比较均有统计学差异(p<0.05)。mdr1、cox-2基因的扩增趋势相同。nmda受体的扩增在m、e、p、s组均显著增高,与c组比较均有统计学差异(p<0.05)。结论:ka反复腹腔注射所致慢性癫痫后,大鼠脑毛细血管p糖蛋白的表达会逐渐增高。癫痫发生后海马cox-2蛋白、p-gp及nmda受体的表达的持续增加,p-gp与cox-2表达规律一致,其高表达与苯妥英钠治疗无关,能被大黄素抑制。nmda受体的高表达不能被苯妥英钠及大黄素抑制。大黄素可能通过cox-2途径影响p-gp的表达,但并非通过抑制谷氨酸与nmda受体结合途径影响cox-2从而影响p-gp的表达。结论1.ka癫痫模型模型具有理想的颞叶癫痫的特征。ka注射后大鼠海马表现出广泛的细胞因子改变,包括促炎细胞因子il-2、il-3、il-4、il-5、il-12、il-13、tgf-β1、tgf-β2等在造模后短期内即出现表达上调,24小时逐渐恢复正常,以及抗炎细胞因子b7-1/cd80、cntf、cntfr、basic-fgf、csk出现表达下调。这些细胞因子都通过jak-stat通路、pi3k-akt通路、mapk信号通路等信号通路影响cox-2信号通路或被其影响。大黄素能抑制ka腹腔注射导致的促炎因子升高及抗炎因子的下调。2.ka反复腹腔注射所致慢性癫痫后,大鼠脑毛细血管p糖蛋白的表达会逐渐增高。癫痫发生后海马cox-2蛋白、p-gp及nmda受体的表达的持续增加,p-gp与COX-2表达规律一致,其高表达与苯妥英钠治疗无关,能被大黄素抑制。NMDA受体的高表达不能被苯妥英钠及大黄素抑制。大黄素可能通过COX-2途径影响P-gp的表达,但并非通过抑制谷氨酸与NMDA受体结合途径影响COX-2从而影响P-gp的表达。3.应用大黄素处理后大鼠表现出癫痫发作级别降低,脑电图提示棘波、尖波等癫痫波发放减少。大黄素能够促进抗癫痫药物苯妥英钠的抗癫痫作用。