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目的:
目前,针对肝脏再生后期相关终止机制的研究较少,肝脏再生后期的相关分子机制尚不清楚。P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧有强大的负调效应,本研究利用小鼠肝再生模型及小鼠原代肝细胞,在体内体外水平探讨P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧在肝再生终止中的表达,作用及其机制。
方法:
1.在C57BL/6小鼠中行2/3肝切除术(Partial Hepatectomy, PH)构造肝脏再生模型,术后2d,3d,5d,7d,10d收集肝脏的样本并提取蛋白及RNA,利用蛋白质免疫印迹(western-blot analysis, WB)及聚合酶链式反应(PCR)检测P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧相关基因在肝脏再生过程中的表达。利用腺病毒及腺相关病毒过表达P53及miR-34a后,WB及PCR检测P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧相关基因以及其下游基因,通过血清酶学及免疫组化等实验检测PH后不同时间点肝脏功能及再生水平,从体内角度探讨P53-miR34a-sirt1正反馈在LR过程中的作用机制。
2.采用超高效液相色谱-质谱联用仪(UHPLC-MS/MS)检测不同时间点肝脏再生组织中的各种胆汁酸成分变化。对质谱检测结果进行相关生物信息学分析以明确LR各个时间点中关键的变化明显的胆汁酸。
3.利用腺病毒转染小鼠原代肝细胞过表达P53,利用WB及PCR检测P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧相关基因以及其下游基因。加入T-β-MCA以及FXR受体激动剂GW4064,从体外角度探讨T-β-MCA对FXR/SHP通路以及P53-miR34a-sirt1正反馈对肝细胞凋亡的影响。通过T-β-MCA灌胃小鼠再对小鼠行2/3肝切除术,观察T-β-MCA对小鼠肝再生的影响,利用WB及PCR检测再生肝组织P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧相关基因以及其下游基因。从体内体外角度探讨T-β-MCA对P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧在LR过程中的作用机制。
4.通过过表达P53质粒转染Huh-7(P53突变型),Hep-3B(P53缺失型),HepG2(P53野生型)肝癌细胞系及FXR/SHP拮抗剂Guggulsterone(GS),利用WB,PCR检测P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧相关基因表达。EdU、TUNEL检测细胞凋亡。从体内体外初步探讨P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧对肝细胞肝癌的影响。
结果:
1.P53在肝再生的早期2d,7d升高明显,P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧在肝再生后期(7d)激活最为明显。分别过表达P53及miR-34a均能进一步激活P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧,提高其下游负调蛋白表达促进其负调效应,抑制肝细胞增殖,提前终止小鼠肝脏再生。
2.检测肝再生2,3,5,7,10天后的小鼠肝脏组织22种胆汁酸含量,统计分析发现其中13种胆汁酸存在统计学差异。T-β-MCA百分比含量在肝再生过程中逐渐增加。T-β-MCA含量绝对值在肝再生第7d达到峰值。
3.过表达P53能在体外激活P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧,T-β-MCA能够抑制FXR/SHP通路活性,促进P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧的负调相应。T-β-MCA饮食能促进肝再生的终止提前激活P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧并促进其负调效应。
4.在P53突变以及P53缺失组中存在P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧的缺失。在Huh-7(P53突变型),Hep-3B(P53缺失型)肿瘤细胞系中转入野生型P53后可以恢复P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧的促细胞凋亡效应。
结论:
1.P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧在肝再生后期激活。分别过表达P53及miR-34a均能进一步激活P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧,提高其下游负调蛋白表达促进其负调效应,抑制肝细胞增殖,提前终止小鼠肝脏再生。
2.T-β-MCA能够抑制FXR/SHP通路活性,促进P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧的负调效应。
3.肝细胞肝癌发生可能由于P53突变导致P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧的缺失。
目前,针对肝脏再生后期相关终止机制的研究较少,肝脏再生后期的相关分子机制尚不清楚。P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧有强大的负调效应,本研究利用小鼠肝再生模型及小鼠原代肝细胞,在体内体外水平探讨P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧在肝再生终止中的表达,作用及其机制。
方法:
1.在C57BL/6小鼠中行2/3肝切除术(Partial Hepatectomy, PH)构造肝脏再生模型,术后2d,3d,5d,7d,10d收集肝脏的样本并提取蛋白及RNA,利用蛋白质免疫印迹(western-blot analysis, WB)及聚合酶链式反应(PCR)检测P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧相关基因在肝脏再生过程中的表达。利用腺病毒及腺相关病毒过表达P53及miR-34a后,WB及PCR检测P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧相关基因以及其下游基因,通过血清酶学及免疫组化等实验检测PH后不同时间点肝脏功能及再生水平,从体内角度探讨P53-miR34a-sirt1正反馈在LR过程中的作用机制。
2.采用超高效液相色谱-质谱联用仪(UHPLC-MS/MS)检测不同时间点肝脏再生组织中的各种胆汁酸成分变化。对质谱检测结果进行相关生物信息学分析以明确LR各个时间点中关键的变化明显的胆汁酸。
3.利用腺病毒转染小鼠原代肝细胞过表达P53,利用WB及PCR检测P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧相关基因以及其下游基因。加入T-β-MCA以及FXR受体激动剂GW4064,从体外角度探讨T-β-MCA对FXR/SHP通路以及P53-miR34a-sirt1正反馈对肝细胞凋亡的影响。通过T-β-MCA灌胃小鼠再对小鼠行2/3肝切除术,观察T-β-MCA对小鼠肝再生的影响,利用WB及PCR检测再生肝组织P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧相关基因以及其下游基因。从体内体外角度探讨T-β-MCA对P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧在LR过程中的作用机制。
4.通过过表达P53质粒转染Huh-7(P53突变型),Hep-3B(P53缺失型),HepG2(P53野生型)肝癌细胞系及FXR/SHP拮抗剂Guggulsterone(GS),利用WB,PCR检测P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧相关基因表达。EdU、TUNEL检测细胞凋亡。从体内体外初步探讨P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧对肝细胞肝癌的影响。
结果:
1.P53在肝再生的早期2d,7d升高明显,P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧在肝再生后期(7d)激活最为明显。分别过表达P53及miR-34a均能进一步激活P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧,提高其下游负调蛋白表达促进其负调效应,抑制肝细胞增殖,提前终止小鼠肝脏再生。
2.检测肝再生2,3,5,7,10天后的小鼠肝脏组织22种胆汁酸含量,统计分析发现其中13种胆汁酸存在统计学差异。T-β-MCA百分比含量在肝再生过程中逐渐增加。T-β-MCA含量绝对值在肝再生第7d达到峰值。
3.过表达P53能在体外激活P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧,T-β-MCA能够抑制FXR/SHP通路活性,促进P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧的负调相应。T-β-MCA饮食能促进肝再生的终止提前激活P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧并促进其负调效应。
4.在P53突变以及P53缺失组中存在P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧的缺失。在Huh-7(P53突变型),Hep-3B(P53缺失型)肿瘤细胞系中转入野生型P53后可以恢复P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧的促细胞凋亡效应。
结论:
1.P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧在肝再生后期激活。分别过表达P53及miR-34a均能进一步激活P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧,提高其下游负调蛋白表达促进其负调效应,抑制肝细胞增殖,提前终止小鼠肝脏再生。
2.T-β-MCA能够抑制FXR/SHP通路活性,促进P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧的负调效应。
3.肝细胞肝癌发生可能由于P53突变导致P53-miR-34a-SIRT1正反馈弧的缺失。