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目的:糖尿病肾病（DN）是常见的糖尿病微血管并发症之一,也是导致终末期肾病发生的主要因素。DN发病机制比较复杂,尚未完全阐明,其中糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱等因素通过多种途径激发肾脏的炎症、氧化应激反应是导致肾脏功能异常、结构改变的主要原因。肾脏的纤维化是DN的主要病理特征之一,肾小球系膜细胞是肾脏主要功能细胞之一。高糖状态下肾小球系膜细胞中大量炎性、纤维化、氧化应激成分的合成与表达是导致系膜扩增,肾脏纤维化的原因。两色金鸡菊Coreopsis tinctoria Nutt.为一年生菊科金鸡菊属植物,以头状花序入药,主含黄酮类成分,也是发挥药效的主要成分。前期研究表明两色金鸡菊具有降血糖、降血脂、抗氧化应激、改善胰岛素抵抗等作用,是否具有防治DN的作用目前尚未见报导。本课题拟建立体内外动物模型,应用两色金鸡菊乙酸乙酯提取物及标志性成分马里苷对模型进行干预,旨在探讨两色金鸡菊对DN大鼠肾脏的保护作用;从NF-κB、AMPK、TGF-β1/Smads信号通路研究两色金鸡菊乙酸乙酯提取物及标志性成分马里苷对DN炎症反应、纤维化病变的抑制作用及作用机制,为两色金鸡菊的进一步开发利用、DN的新药研发提供理论依据。方法:1)HPLC-MS法对两色金鸡菊乙酸乙酯提取物进行含量测定与分析;2)采用高脂高糖饲料喂养8w,链脲佐菌素（STZ）腹腔注射SD大鼠72h后,建立糖尿病（DM）模型,继续高脂高糖饲料喂养4w,依据肾功指标、肾脏病理特征判断模型是否成功;3)依据DN成模条件,采用两色金鸡菊乙酸乙酯提取物600mg/kg、300mg/kg、150mg/kg预防给药DN大鼠4w后,观察大鼠血糖、血脂、肾功指标的变化。HE、Masson、PAS染色法同时观察大鼠病理改变;4)免疫组化法、Realtime-PCR法、Western blot法检测各组大鼠肾组织炎性因子表达的变化。高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞建立体外模型,Realtime-PCR法、Western blot法检测各组细胞中炎性因子MCP-1、ICAM-1表达的变化。分别采用高糖及NF-κB拮抗剂PDTC诱导细胞后,观察两色金鸡菊乙酸乙酯提取物、标志性成分马里苷对NF-κB信号通路中p65蛋白以及炎症因子表达的影响,以明确药物抑制DN大鼠肾脏炎症反应的作用机制;5)采用MTT法、CCK8法检测两色金鸡菊乙酸乙酯提取物、标志性成分马里苷对细胞增殖的抑制作用;采用Realtime-PCR法、Western blot法进一步观察两色金鸡菊乙酸乙酯提取物及标志性成分马里苷对肾脏纤维化蛋白TGF-β1、CollagenⅣ、FN表达的影响;采用高糖及NF-κB拮抗剂PDTC诱导细胞后,干预两色金鸡菊乙酸乙酯提取物及标志性成分马里苷,观察下游纤维化蛋白表达的改变;进一步观察两色金鸡菊乙酸乙酯提取物及标志性成分马里苷对AMPK、TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达影响。分别采用高糖及AMPK激动剂AICAR、拮抗剂Dorsomorphin诱导细胞后,干预两色金鸡菊乙酸乙酯提取物及标志性成分马里苷观察下游信号蛋白Smad4以及纤维化因子表达的改变,明确药物抑制大鼠肾脏纤维化病变的分子作用靶点。结果:1)HPLC-MS分析两色金鸡菊乙酸乙酯提取物中主含马里苷、黄酮马里苷、绿原酸、二咖啡奎宁酸。其中马里苷含量相对较高为181.61mg/g,初步认定马里苷为两色金鸡菊乙酸乙酯提取物中主要成分之一;2)采用高脂高糖诱导SD大鼠8w后,STZ腹腔注射SD大鼠建立DM模型后,继续高脂高糖饲料喂养4w可见临床早期DN肾脏损伤的标志性指标尿微量白蛋白、β2-MG和α1-MG的显著增加。病理特征表现为:肾小球基底膜增厚及系膜增宽、肾小球及肾小管糖原物质、胶原纤维聚集等特征,此造模方法可模拟早期DN基本特征;3)在此造模方法基础上,预防给药两色金鸡菊乙酸乙酯提取物,结果显示,药物能降低DN大鼠随机血糖、血脂水平,改善大鼠糖脂代谢紊乱,保护肾脏功能,延缓肾脏病理损伤;4)对大鼠肾脏炎症反应的实验表明,两色金鸡菊乙酸乙酯提取物能抑制肾组织中炎性因子MCP-1、ICAM-1的表达;体外细胞实验表明,两色金鸡菊乙酸乙酯提取物及标志性成分马里苷通过影响NF-κB信号通路,抑制高糖诱导肾小球系膜细胞中炎性因子MCP-1、ICAM-1的表达,马里苷高剂量组的抑制活性显著高于两色金鸡菊乙酸乙酯提取物高剂量组;5)对大鼠肾脏纤维化病变的实验结果表明两色金鸡菊乙酸乙酯提取物能抑制肾组织中纤维化成分TGF-β1、CollagenⅣ、FN的表达;体外细胞实验进一步证实两色金鸡菊乙酸乙酯提取物及标志性成分马里苷通过NF-κB、AMPK/Smad4、TGF-β1/Smads信号通路下调纤维化蛋白表达的作用,两色金鸡菊乙酸乙酯提取物高剂量组抑制活性显著高于马里苷高剂量组。结论:两色金鸡菊乙酸乙酯提取物能预防STZ诱导的DN大鼠早期肾损害的发生发展。两色金鸡菊乙酸乙酯提取物可能通过对DN发病过程中肾脏炎症反应、纤维化病变的抑制而发挥防治DN作用。通过作用于NF-κB、AMPK/Smad4、TGF-β1/Smads信号通路而延缓肾脏炎症反应与纤维化的病变过程,其中马里苷可能为两色金鸡菊乙酸乙酯提取物中肾脏炎症反应的主要成分。