研究背景:胰腺癌(Pancreatic Cancer,PC)是一种高侵袭性、高致命性的恶性肿瘤,具有发病隐匿、缺乏特征性症状等特点,这就决定了该病患者手术切除率低且术后死亡率高。目前,胰腺癌的临床治疗主要以抗代谢药物(如5-氟尿嘧啶、吉西他滨和NAB紫杉醇等)治疗和靶向药物(如贝伐单抗、西妥昔单抗等)治疗为主。在过去的十年中,尽管抗代谢治疗和靶向治疗得到了较好的发展,但由于胰腺癌表型的高侵袭性及其对化疗药物的耐药性等,致使患者的生存率并无明显的改善。因此,深入探究胰腺癌发生发展的分子机制、寻找更为有效的诊断和治疗干预靶点对于改善胰腺癌患者的预后和生存质量具有非常重要的意义。多聚腺苷酸结合蛋白相互作用蛋白 1(Polyadenylate-binding protein-interacting protein 1,PAIP1)是由PAIP1基因(位于5p12)编码的含有479个氨基酸的磷酸腺苷结合蛋白。它可与EIF4A、EIF3结合刺激翻译起始,参与调控细胞的生长、增殖和分化。同时,PAIP1也参与mRNA的稳定--通过与主要蛋白编码区的不稳定性决定因子(MCRD)结合稳定c-fos原癌基因的mRNA。研究显示,这一步骤失控将会导致c-fos基因的异常表达,从而促进肿瘤细胞的生长和恶性演进。Scotto等通过使用单核苷酸序列分析和荧光原位杂交技术发现PAIP1可能参与子宫颈癌的演进过程。Piao等报道显示,PAIP1的高表达与乳腺癌患者的临床分期、组织学分级及不良预后密切相关。此外,Wang等研究发现,PAIP1蛋白可通过调节AKT/GSK-3信号通路抑制肺癌细胞的增殖和EMT进程。这些结果均提示,PAIP1在多种恶性肿瘤的演进中扮演着重要角色。但目前为止,PAIP1蛋白在胰腺癌中的表达、功能及分子机制尚不清楚。因此,β待探究PAIP1蛋白在胰腺癌中的作用机制和生物学功能对于探寻胰腺癌治疗新分子靶点、改善胰腺癌患者的预后具有重要意义。研究目的:探讨PAIP1基因蛋白对胰腺癌生物学功能的影响,阐明其在胰腺癌演进中的作用及分子机制。(1)分析PAIP1基因蛋白的表达水平与胰腺癌患者临床病理参数之间的相关性,为胰腺癌患者的早期诊断及预后评估提供可能的新分子标志物。(2)探讨PAIP1基因蛋白异常表达对胰腺癌细胞的增殖、转移和血管生成的作用及机制。(3)初步阐明PAIP1对胰腺癌细胞体内和体外生物学功能行为的影响以及PAIP1调控胰腺癌演进的具体分子机制。材料与方法:(1)组织标本及数据库分析:采用免疫组织化学染色方法检测104例胰腺癌组织和27例正常胰腺组织的PAIP1蛋白表达,并分析PAIP1蛋白表达水平与胰腺癌患者临床病理学特征之间的相关性。应用TCGA和The Human Protein Atlas数据库挖掘PAIP1蛋白高表达对胰腺癌患者预后评估的意义。(2)体外实验:采用western blot方法检测 PAIP1 蛋白在 5 种胰腺癌细胞株(SW1990、Miapaca-2、Bxpc-3、Capan-1 和 panc-1)中的表达情况,并根据PAIP1蛋白的表达水平,选取Bxpc-3和Capan-1细胞进行PAIPI的慢病毒沉默处理,选取MIAPaCa-2进行PAIP1的慢病毒过表达处理。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化铵实验和平板克隆形成实验检测PAIP1蛋白对胰腺癌细胞DNA复制能力和增殖能力的影响。通过细胞划痕实验、transwell实验检测PAIP1蛋白对胰腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。利用免疫荧光实验和western blot实验检测差异表达PAIP1蛋白后,胰腺癌细胞EMT相关标志物的表达变化。采用western blot法检测PAIP1蛋白差异表达对PI3K/AKT通路的影响。此外,采用血管形成实验、血管生成拟态实验、鸡胚尿囊膜实验及western blot方法检测PAIP1蛋白对胰腺癌血管生成能力的影响。(3)体内实验:首先,将差异表达PAIP1蛋白的胰腺癌细胞分别接种到裸鼠皮下,对比不同组别的裸鼠移植瘤的生长情况。其次,将不同组别的胰腺癌细胞通过裸鼠尾静脉注射建立体内转移瘤模型,并比较PAIP1蛋白差异表达对裸鼠肺部转移的影响。最后,采用免疫组织化学染色方法检测各组别裸鼠肿瘤组织中PAIP1、Ki67、E-cadherin和Vimentin蛋白的表达水平,并应用HE染色分析肺组织转移灶的形成情况。结果:(1)PAIP1蛋白与胰腺癌预后不良的相关性:IHC结果显示PAIP1蛋白主要表达于胰腺癌细胞的细胞浆内,且呈高表达;PAIP1在胰腺癌组织中的阳性率和强阳性率分别为71.4%和58.2%,明显高于癌旁正常胰腺组织(其阳性率及强阳性率分别为18.5%和3.7%),且PAIP1蛋白高表达与肿瘤大小、组织学分级、临床分期和淋巴结转移密切相关。根据TCGA和The Human Protein Atlas数据库中的数据显示,PAIP1高表达的胰腺癌患者其生存期明显短于PAIP1低表达的胰腺癌患者。(2)PAIP1蛋白高表达可促进胰腺癌的增殖:MTT和平板克隆形成实验结果显示,PAIP1蛋白高表达促进胰腺癌细胞的增殖和克隆形成能力;体内实验进一步证明,PAIP1高表达可促进裸鼠皮下肿瘤的形成。提示PAIP1高表达可促进胰腺癌的增殖。(3)PAIP1通过EMT进程促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭:细胞划痕实验、transwell实验表明,在Bxpc-3和Capan-1细胞中沉默PAIP1可明显抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力,而PAIP1过表达则结果相反。进一步的体内实验表明,与对照组相比,尾静脉注射sh-PAIP1胰腺癌细胞的裸鼠肺部转移灶形成数量明显减少,而PAIP1高表达处理则显著增加。此外,western blot结果显示PAIP1高表达可下调上皮标志物E-cadherin的表达,上调间充质标志物Vimentin、Slug、Snail以及基质金属蛋白酶MMP2的表达水平。提示PAIP1蛋白可能通过诱导EMT进程促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭。(4)PAIP1蛋白高表达可促进胰腺癌的血管形成能力:微管形成实验和血管拟态形成实验发现,沉默PAIP1蛋白的表达可降低胰腺癌细胞的血管生成能力,而PAIP1蛋白高表达则促进胰腺癌细胞的血管生成能力。此外,鸡胚尿囊膜实验发现,与对照组相比,沉默PAIP1后可显著抑制新生血管的形成,PAIP1蛋白高表达则结果相反。随后,western blot结果也表明,PAIP1蛋白沉默可显著下调VEGF的表达水平。提示PAIP1蛋白可促进胰腺癌的血管生成能力。(5)PAIP1蛋白通过激活PI3K/AKT通路调控胰腺癌的血管生成和转移:加入PI3K抑制剂LY294002后可显著降低PAIP1蛋白高表达所诱导的胰腺癌细胞增殖、转移和血管生成能力。进一步检测EMT标志物和VEGF蛋白的表达水平发现,PI3K抑制剂可调控PAIP1蛋白高表达所诱导的EMT进程、下调VEGF的表达水平。提示PAIP1蛋白通过PI3K/AKT通路调控胰腺癌的血管生成和转移。结论:(1)PAIP1蛋白高表达与胰腺癌的组织学分级、临床分期、淋巴结转移、血管生成和不良预后密切相关。(2)PAIP1高表达通过EMT过程促进胰腺癌细胞增殖及转移,而沉默PAIP1蛋白则逆转胰腺癌的恶性演进。(3)PAIP1高表达可在体内、外促进胰腺癌的血管形成。(4)PAIP1蛋白通过PI3K/AKT信号通路促进胰腺癌的转移、血管形成和EMT进程。