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前言 乳腺癌是危害女性健康的常见恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势。化疗在乳腺癌的治疗中占有重要地位，然而，多药耐药(MDR)的产生严重影响了化疗的临床疗效。多药耐药产生的机制众多，其中ABC转运蛋白过表达扮演着重要角色。目前，已有文献报道ABC转运蛋白超家族成员P-gp，MRP1，BCRP和LRP参与了MDR的产生。BCRP由位于人染色体4q22的ABCG2基因编码，包含2.4kbmRNA翻译的655个氨基酸残基、一个ATP结合域和一个疏水性跨膜结构域。Ross等人发现在结肠癌、纤维肉瘤、乳腺癌、胃癌和多发性骨髓瘤等耐药细胞株中BCRP表达增加。BCRP高表达可特异性增加肿瘤细胞对米托蒽醌(MX)的转运能力，减少肿瘤细胞内MX的蓄积，从而降低MX的肿瘤杀伤作用产生耐药。因此靶向调控BCRP表达对于逆转乳腺癌MDR具有很重要的意义。 微小RNA(microRNA，miRNA)是长度约22nt的内源性短链RNA，在个体发育、细胞分化、增殖及凋亡等生理活动、以及在肿瘤发生发展等病理过程中起重要调控作用。miRNA一般通过与目标mRNA的3端非编码区域(3UTR)互补结合后，在转录后水平调节靶基因的翻译和表达。由于BCRPmRNA3UTR长度为1970个碱基，远长于人类mRNAs3UTR的平均长度700bp，提示BCRPmRNA3UTR可能存在miRNA调控BCRP表达的作用靶点。目前，已有研究发现BCRPmRNA3UTR存在许多miRNA的作用靶点。Saito等发现miR-328，-519c和-520h能够通过抑制转录和降解mRNA调节ABCG2mRNA和蛋白表达。Li等在对乳腺癌MX耐药细胞中研究中证实，miR-519c可能通过降解ABCG2mRNA，下调ABCG2蛋白表达水平，进而增加细胞内MX的蓄积。课题组前期研究中也发现，miR-181a和miR-487a均能与BCRP3UTR结合，下调BCRP的表达，并逆转乳腺癌MX耐药细胞的耐药性。以上研究均证实，miRNA能够调控BCRP的表达。但同时亦发现以上miRNA只能部分逆转BCRP介导的乳腺癌细胞耐药作用，说明单一miRNA作用的局限性。那么是否存在其它miRNAs参与调控引起课题组关注。 miRNA基因簇(miRNAcluster)是一组miRNA基因在染色体上成簇排列形成的基因群。研究表明大多数miRNAs（个别miRNAs除外）对其靶基因只起微调作用，说明单一miRNA作用的局限性。由同源性miRNAs组成的miRNA基因簇因具有相同的顺式反应原件（如启动子等），如其中某个成员遭受突变而被淘汰，另外几个同源的miRNA会继续发挥功能，正如一些蛋白质编码基因可能在同一个细胞通信通路中协同工作一样，miRNA基因簇各组分会有某种意义上出现“协同”作用。因此，研究miRNA基因簇编码的miRNAs的协同作用更具价值。 miR-302/367基因簇位于人号染色体4q25，该家族包括miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-302b-3p、miR-302b-5p、miR-302c-3p、miR-302c-5p、miR-302d-3p、miR-302d-5p、miR-367-3p和miR-367-5p10个成员，在胚胎干细胞中高表达，在其成熟过程中，miR-302/367簇中各“-5p”成分迅速降解，而各“-3p”成分也随着细胞的分化逐渐减少。miR-302/367基因簇各“-5p”成员的不稳定性和其几乎不具有生物学活性，习惯认为miR-302/367基因簇由各“-3p”5个成员组成，即miR-302a-3p、miR-302b-3p、miR-302c-3p、miR-302d-3p和miR-367-3p，故文章中将略去“-3p”后缀;其中miR-302a，miR-302b，miR-302c，miR-302d具有相同种子区(一般将其统称为miR-302S)，提示此4个miRNA具有相同或相似功能，而miR-367的种子序列不同于miR-302S，但仍可靶向作用于许多与miR-302S相似靶基因，并且miR-302/367基因簇各成员在基因组中位置毗邻，具有相同点启动子和转录起始位点，提示miR-302/367基因簇各成员间可能存在协同作用。作为胚胎干细胞特异性miRNAs，miR-302/367基因簇可维持细胞干性及自我更新能力，并在早期胚胎发育、性别决定等生理过程中发挥关键作用。目前miR-302/367基因簇的研究主要集中于诱导体细胞形成多能干细胞(iPSCs)，并且由miR-302/367基因簇介导的诱导型多能性干细胞无致瘤性。最新研究表明miR-302/367基因簇可以增加肝癌源性iPS细胞对5-FU及IFN-α的药物敏感性。 通过生物信息预测发现，由miR-302/367基因簇编码的miR-302a、miR-302b、miR-302c和miR-302d均与BCRP的3UTR存在两个可能的结合位点，且预测miR-302a、miR-302b、miR-302c和miR-302d与其中一个可能位点S结合的吉布斯能变化(△G)小于-20kcal/mol，提示miR-302a、miR-302b、miR-302c和miR-302d具有较强的与BCRPmRNA3UTR结合能力，表明miR-302-367基因簇编码的miRNAs可能参与了乳腺癌耐药细胞BCRP的表达调控。 课题组前期发现miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d和miR-367在乳腺癌细胞中均低/失表达，且在BCRP高表达的MCF-7/MX细胞中表达更低，提示miR-302/367基因簇低/失表达可能参与乳腺癌化疗耐药的形成。miR-302/367基因簇编码的miRNAs是否能够协同调节BCRP的表达并进一步影响其介导的药物敏感性还未见报道。本研究首先通过荧光素酶报告基因分析实验验证miR-302/367基因簇与BCRP3UTR的结合情况，建立乳腺癌药物敏感细胞MCF-7及其诱导的MX耐药MCF-7/MX细胞中miR-302/367基因簇及各成员高表达模型，检测细胞转染后BCRPmRNA及蛋白表达水平、对细胞的敏感性及外排能力的影响，细胞水平探讨miR-302-367基因簇编码的miRNAs调控乳腺癌细胞BCRP表达与功能的协同效应及可能机制，为研究乳腺癌耐药性形成与逆转的新切入点提供理论与实验依据。 实验方法 生物信息软件预测，BCRPmRNA3UTR区域存在与miR-302/367基因簇种子区相结合的位点。荧光素酶报告分析确认BCRPmRNA的3UTR与miR-302S的结合位点。采用脂质体转染法对人乳腺癌药物敏感细胞MCF-7和耐药细胞MCF-7/MX进行转染;qRT-PCR验证miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d、miR-367和miR-302/367基因簇(后文中简称为cluster)过表达细胞模型建立;qRT-PCR及WesternBlot分析BCRP等耐药蛋白mRNA及蛋白水平。MTS法检测MCF7/MX和MCF-7细胞对MX的敏感性。流式细胞术检测转染miR-302/367基因簇及各成员后，MCF7/MX及MCF-7细胞对MX的药物外排能力。 实验结果 1.验证miR-302/367基因簇与BCRPmRNA3UTR直接结合:通过生物信息软件预测，发现BCRP的3UTR区域存在两个能与miR-302S种子区相结合的位点。荧光素酶报告基因分析结果显示，与阴性转染组（NCmimic与pGL3-BCRP-3UTR-FULL共转染）比较，miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d和clustermimic分别与PGL3-BCRP3UTR-FULL共转染后，荧光素酶活性均明显降低(P＜0.05)，且cluster最为明显，miR-367组变化无显著性差异（P＞0.05）;进一步构建BCRP-3UTR区突变质粒pGL3-BCRP-3UTR-MUT，与阴性转染比较(NCmimic与pGL3-BCRP-3UTR-MUT共转染)，miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d、miR-367和clustermimic分别与PGL3-BCRP3UTR-MUT共转染后，荧光素酶活性均无明显变化（P＞0.05），表明BCRPmRNA的3UTR存在miR-302S的直接结合位点。 2.检测miR-302/367基因簇转染后的MCF-7和MCF-7/MX细胞中BCRPmRNA及蛋白表达水平变化:将miR-302/367基因簇各成员mimics及阴性对照转染至MCF-7细胞和MCF-7/MX细胞后48小时，与阴性对照组相比，miR-302/367基因簇各成员表达均显著上调(P＜0.05)，即通过转染miR-302/367基因簇及各成员mimics，可成功建立MCF-7、MCF-7/MX细胞中miR-302/367基因簇及各成员过表达模型。采用qRT-PCR及WesternBlot分析发现，转染miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d和cluster后，MCF-7和MCF-7/MX细胞BCRPmRNA及蛋白水平均明显下调(P＜0.05)，且cluster转染组下调最为明显(P＜0.05)，miR-367组无明显变化;进一步比较两株细胞中BCRP表达变化差异，结果发现MCF-7/MX细胞中BCRP表达下调较MCF-7细胞更为明显(P＜0.05)。 3.检测miR-302/367基因簇转染后MCF-7、MCF-7/MX对MX的敏感性变化:结果显示，与阴性对照组相比，MCF-7和MCF-7/MX细胞miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d和cluster组IC50均明显减小(P＜0.05)，且cluster组减少最为明显;MCF-7细胞中miR-367组IC50无明显变化(P＞0.05)，但MCF-7/MX细胞中miR-367组IC50明显减小(P＜0.05);MCF-7/MX细胞中转染miR-302b、miR-302c、miR-302d、miR-367和cluster后，与MCF-7细胞相同处理组相比IC50变化更为明显。 4.检测miR-302/367基因簇转染后MCF-7、MCF-7/MX细胞MX外排能力变化:结果显示，与阴性对照组相比，MCF-7和MCF-7/MX细胞中miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d、miR-367和cluster组处理后细胞内MX药物浓度均明显增加(P＜0.05)，且cluster组增加最为明显;MCF-7/MX细胞中转染miR-302b、miR-302c、miR-302d和cluster后，与MCF-7细胞相同处理组相比，细胞内MX药物浓度增加更为明显(P＜0.05)。 结论 1.BCRPmRNA的3UTR存在miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d的直接结合位点。 2.miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d和cluster均可降低BCRPmRNA及蛋白水平，且cluster对BCRP表达抑制作用更为明显。 3.miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d和cluster均可增加MCF-7/MX及MCF-7细胞对MX的敏感性，且cluster增加MX药物敏感性作用更为明显。 4.miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d和cluster可减少MCF7/MX及MCF-7细胞对MX的外排作用，增加MX在细胞内蓄积，且cluster作用更为显著;miR-367可减少MCF-7/MX对MX的外排作用，增加MX在细胞内蓄积。 5.miR-302/367基因簇及miR-302b、miR-302c、miR-302d在BCRP高表达的MCF7/MX细胞中增加MX药物敏感性更为明显。 6.miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d和cluster可通过靶向结合BCRPmRNA3UTR，抑制BCRP表达，减少细胞对MX的外排能力，增加MX细胞内蓄积，提高乳腺癌细胞MX药物敏感性。 7.miR-302/367基因簇可靶向作用BCRP，协同调控乳腺癌细胞药物敏感性。