论文部分内容阅读
本论文从中华开菲尔菌粒中筛选到一株能高效、高选择性、遵循反Prelog规则催化TMSE不对称还原生成对映体纯(R)-TMSOL的醋酸杆菌,并且对比研究不同介质中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原成(R)-TMSOL的反应过程,探讨离子液对该反应的影响规律,揭示含离子液介质中醋酸杆菌细胞的催化特性,并以此为基础,建立起可用于高效、高选择性合成对映体纯(R)-TMSOL的生物催化反应体系。
从中华开菲尔菌粒中分离得到三株菌:XZY001、XZY003、XZY004。通过形态学和生理生化的初步鉴定,菌株XZYOOI属于乳酸菌中的乳杆菌属短乳杆菌种;菌株XZY004属于酵母菌中的毕赤酵母属;菌株XZY003属于醋酸菌中的醋酸杆菌属。其中,菌株XZY003催化TMSE不对称还原为(R)-TMSOL的效果最好,进一步的16S rRNA基因序列分析表明,其属于醋酸杆菌属亚种,命名为Acetobacter sp. CCTCC M209061。
在供试的微生物菌种中,醋酸杆菌细胞能高效催化TMSE不对称还原生成(R)-TMSOL。在水相反应体系中,醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的最适pH值、辅底物、辅底物浓度、反应温度、底物浓度和振荡速度分别是5.0、异丙醇、130.6mmol/L、30℃、6.0 mmol/L和180 r/min;在此最适条件下,反应的初速度、最大产率及产物的e.e.值分别为0.50μmol/min、71%和99%以上。显然,最大产率和最适底物浓度较低,这可归因于水相中存在较为严重的底物和产物抑制、底物分解和逆反应。
为了进一步提高反应底物浓度和反应效率,本研究尝试采用相转移的方法,以期利用第二相对底物和产物的萃取作用,降低水相中底物和产物的浓度,从而减轻底物和产物抑制、底物分解和逆反应。有机溶剂/缓冲液是常见的双相反应体系,为此,首先在不同有机溶剂与缓冲液组成的双相体系中进行醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应。发现不同有机溶剂对该反应的影响各异。在所研究的有机溶剂中,疏水性较强的正己烷为最适有机相。在正己烷/缓冲液双相反应体系中,该反应的最适两相体积比、底物浓度、缓冲液pH值、反应温度和振荡速度分别为1/2(缓冲液/正已烷)、9.0 mmol/L、5.0、30℃和180 r/min;在上述最佳反应条件下,反应初速度、最大产率和产物e,e.值分别为1.82μmol/h、90%和>99%。与水相反应体系相比,正己烷/缓冲液双相反应体系有效地解决了底物的分解等问题,显著提高了该反应的最适底物浓度和最大产率。然有机溶剂对细胞有一定的毒性作用,导致该反应速度较慢。
为解决上述问题,本文采用具有良好生物相容性的疏水性离子液替代有机溶剂。在所研究的疏水性离子液中,C4MIM-PF6为该反应的最适第二相。在C4MIM-PF6/缓冲液双相反应体系中,醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的最适两相体积比、底物浓度、缓冲液pH值、辅底物浓度、反应温度和振荡速度分别为4/1(缓冲液/C4MIM·PF6)、36.0 mmol/L、5.0、555.7 mmol/L、30℃和200 r/min;在上述最佳反应条件下,反应初速度、最大产率和产物e.e.值分别为9.5/nnol/h、95%和>99%。显然,C4MIM·PF6/缓冲液双相反应体系能大大提高该反应的最适底物浓度、反应初速度及最大产率。
相比于水相反应体系和正已烷/缓冲液反应体系,醋酸杆菌细胞在含离子液的反应体系中具有较好的操作稳定性,在所研究的三种反应体系中,醋酸杆菌细胞在C4MIM·PF6/缓冲液双相反应体系中具有最好的操作稳定性,在含有机溶剂的双相反应体系中其操作稳定性最差,这可能是由于离子液较有机溶剂具有较低的细胞毒性。
文中首次利用可望取得自主知识产权的醋酸杆菌Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞为生物催化剂,其在含离子液介质中能高效、高选择性、遵循反Prelog规则催化TMSE不对称还原生成对映体纯的(R)-TMSOL,该反应的最大产率及产物的对映体选择性均远高于现有报道的对应值。本研究不仅有助于丰富对含离子液介质中生物催化的认识,还提供了一条高效制备对映体纯手性有机硅醇的新途径。