背景临床上麻醉维持及各种休克、感染、外伤等导致的呼吸衰竭,人口老龄化及空气雾霾等导致的机体氧合障碍,使得呼吸机辅助治疗越来越普遍,机械通气已经成为临床上挽救生命的一种必不可少的治疗手段。而使用呼吸机过程中,不恰当的通气参数设置和通气模式选择会损坏气道和肺泡,病人常会发生病情加重,氧合能力下降和肺功能严重受损,即机械通气相关性肺损伤(Ventilator-induced lung injury,VILI)。VILI 发生后,会引起全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS),其致死率极高。VILI造成了巨大的经济和社会负担,预防和治疗VILI成为当前临床机械通气患者治疗的重点。VILI发生机制尚未明确,但不论何种原因诱发的肺损伤,其共性特征和首要表现为肺水肿。肺水肿主要病理生理改变为肺泡膜通透性增加,肺泡及间质内组织液积聚,炎症因子和炎性细胞浸润、低氧血症,肺水肿的形成会影响血气交换进而危及各脏器功能和生命安全。因此,预防肺水肿是避免VILI发生的关键环节,早期肺水肿的预防可以抑制或减轻后续系列损伤和反应。VILI中由于机械力、炎症、低氧等导致肺泡膜完整性被破坏,细胞间隙增加,肺水转运失常。应用呼吸机或麻醉机进行机械通气时,肺泡上皮细胞和气管最先受到机械力的牵张刺激,然后机械力进一步作用于血管内皮细胞等肺泡壁组织。有报道及我们前期研究均已表明肺上皮细胞膜的完整性及细胞间紧密连接和粘附连接的状态影响肺泡膜的屏蔽与过滤功能,对肺泡膜通透性有关键作用,而维持其细胞结构完整和功能正常需要足够的能量支持。线粒体作为能量供应的主要场所,参与细胞内多项生命活动,在维持细胞内稳态中扮演重要角色。线粒体供能作用的正常是维持细胞各项生命活动有序进行的先决条件。各种原因导致的线粒体破坏可引起其产能障碍,从而引起细胞各功能异常及组织器官结构和功能改变。然而,VILI中线粒体是否被损伤,若发生损伤其机制及预防措施都有待探讨。有报道NLRP3炎性小体参与炎症反应和VILI的过程,且NLRP3与线粒体紧密相关。NLRP3蛋白是NLRP3炎性小体的核心部分。外界电流,LPS等有害刺激会使NLRP3通过ASC与procaspase-1结合,招募和激活促炎症蛋白酶Caspase-1。活化的Caspase-1促进细胞质中前炎性因子的切割和成熟(Pro-IL-1 β,Pro-IL-18和IL-33)。Pro-IL-1 β被Caspase-1切割,释放出成熟的炎症因子IL-1 β。VILI中NLRP3炎性小体的激活是否对线粒体有直接影响尚待研究发现。p120连环蛋白(p120,p120-catenin)是细胞粘附连接中的关键组成蛋白,其在肺上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞等有分布。以往研究表明p120可以稳定E-cadherin在细胞膜上的位置,抑制occludin降解和E-cadherin内吞,加强细胞内骨架蛋白的牢固性,从而防止肺血管通透性增加,降低肺水肿的发生率。同时VILI中,p120通过与RhoA结合抑制RhoA活性,进而抑制TLR4与MyD88结合,有效阻断TLR4信号通路,参与机体抗炎反应。以往研究注重于VILI信号转导机制、炎症因子的释放和集聚等。VILI中,构成肺泡膜的细胞内线粒体结构或功能是否异常或破坏?若线粒体发生异常,是通过何种机制所致?对肺损伤产生何种影响?抑制线粒体破坏或修复其功能可否逆转或减轻肺损伤肺水肿?NLRP3炎性蛋白在机械通气肺损伤中的变化及其与线粒体相互作用的机制,p120作为细胞粘附连接的关键组成部分,充当a set point的角色,它调控NLRP3及与线粒体的关系进而影响肺损伤、肺水肿的机制目前尚未明确。我们考虑p120对肺损伤的保护作用除了稳定细胞膜通透性及其细胞内骨架蛋白之外,是否可通过抑制TLR4及ROS信号转导通路,从而抑制NLRP3炎性小体形成,进一步抑制NLRP3对线粒体结构及功能的破坏,从而起到肺保护作用。对此,我们疑问:1.机械牵张过程中,NLRP3炎性蛋白的变化是否能直接影响线粒体从而诱发肺损伤?2.p120在机械牵张过程中能否对NLRP3炎性蛋白进行负性调节以及发挥保护线粒体的功能?3.p120既然是a set point protein,可否通过调节p120表达来抑制NLRP3进而抑制NLRP3炎性小体的激活,减轻线粒体损害,减轻VILI,为临床VILI防治提供生物转化新思路。4.如果上述改变能够成立,在活体机械通气诱发肺损伤、肺水肿过程中其改变与作用、影响与意义如何?因此,p120,NLRP3和线粒体三者之间的关系需要深入探讨。本研究运用体内和体外两种VILI的模型探索p120对线粒体保护作用及其机制。我们提出假说:在VILI中,p120能够通过抑制TLR4信号通路和氧化应激中ROS生成来抑制NLRP3的激活,进一步减少对线粒体结构和功能的损伤,从而防止肺损伤、肺水肿的形成。同时p120通过抑制NLRP3炎性小体释放活性炎症因子IL-1 β等,不仅对细胞内线粒体功能起到保护作用,而且可抑制全身炎性反应,具有广义的脏器保护价值。研究目的本研究通过建立细胞机械牵张和动物机械通气两种模型1.探讨VILI过程中线粒体和NLRP3的变化及两者的关系;2.揭示p120对NLRP3的负性调节及对线粒体保护的可能途径和机制进而避免VILI,为VILI基础研究提供新思路;3.从NLRP3炎性小体和线粒体产能角度,在肺损伤的源头阐释细胞连接蛋白p120和线粒体作为VILI中直接作用和有效干预的靶点所担当的角色,为临床上VILI的防治提供新靶点。研究方法本研究将肺泡上皮细胞、机械通气肺损伤模型小鼠和基因敲除小鼠作为研究对象,采用特异性抑制剂处理、siRNA转染技术、免疫蛋白印记(Western Blot)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、流式细胞术(Flow Cytometry)、透射电镜、苏木素-伊红(HE)和伊文氏蓝(Evans blue)染色等手段,检测TLR4信号通路、ROS激活、NLRP3炎性蛋白及炎性小体激活产物、线粒体结构和功能变化及肺损伤、肺水肿的程度,为防治机械通气相关性肺损伤提供新的治疗思路和理论依据。第一部分:机械牵张过程中NLRP3对线粒体和ROS的影响单层生长的小鼠肺上皮细胞株MLE-12种于普通6孔细胞培养板和牵张专用六孔板。本研究采用Flexcell-5000T牵张系统牵张MLE-12,模拟临床上呼吸机通气。细胞机械牵张参数设置.:牵张幅度20%,频率0.5HZ,牵张松弛比为1:1,牵张时间4h。MCC950处理组加入NLRP3特异性抑制剂MCC950预处理MLE-12细胞1小时后,再进行机械牵张。随机分组:将单层肺上皮细胞MLE-12分为C组(对照组)、CS组(牵张组)、D组(DMSO处理组)、CS+M组(牵张前MCC950预处理1小时组)。1.JC-1探针进行荧光探针装载细胞,用流式细胞仪检测线粒体膜电位变化并以PE/FITC值表示其变化。2.用RIPA裂解液提取细胞蛋白,用Western Blot方法检测各组NLRP3、β-catenin的表达量。3.DCFH-DA探针进行荧光探针装载细胞,用流式细胞仪检测每组细胞中活性氧(ROS)的水平,以FITC值的改变表示细胞活性氧的变化。第二部分:机械牵张过程中p120对NLRP3和线粒体的影响及调控机制单层生长的小鼠肺上皮细胞株MLE-12种于普通6孔细胞培养板和牵张专用六孔板。本研究采用Flexcell-5000T牵张系统牵张MLE-12,模拟临床上呼吸机通气。细胞机械牵张参数设置:牵张幅度为20%,频率0.5HZ,牵张松弛比为1:1,牵张时间4h。分别采用 Sc siRNA、p120 siRNA 及转染试剂 Lipofectamine 2000 转染MLE-12细胞,下调p120基因表达,细胞经转染6h后换液,然后将各组细胞在37℃,5%CO2孵箱中培养48小时,再进行后续实验处理。随机分组:将单层肺上皮细胞MLE-12分为1.Sc siRNA,10nM p120 siRNA、30nM p120 siRNA、50nM p120 siRNA 组;2.Sc siRNA 组、Sc siRNA+CS(机械牵张)组、p120 siRNA 组、p120 siRNA+CS(机械牵张)组。1.对MLE-12细胞用p120siRNA进行转染,设置转染的浓度梯度以确定出最佳转染浓度。2.牵张实验完毕后,加入RIPA裂解液提取MLE-12细胞蛋白,用Western Blot方法检测各组 NLRP3、p120、β-catenin、TLR4、PhosphoNF-κ B、NF-κ B 和 ICAM1的表达量。3.各组处理结束后取细胞上清液用小鼠ELISA试剂盒进行定量检测细胞培养上清液中IL-I β的含量。4.各组MLE-12细胞经牵张后,免疫荧光共聚焦显微镜下观察不同处理组细胞NLRP3与Caspase-1的结合程度及表达分布情况。5.各组处理完毕后,DCFH-DA探针进行荧光探针装载细胞,用流式细胞仪检测每组细胞中活性氧(ROS)的水平,以FITC值的改变表示细胞活性氧的变化。6.机械牵张完毕后,制作超薄切片,透射电镜下观察各组线粒体及细胞内部结构改变情况。7.各组处理完毕后,JC-1探针进行荧光探针装载细胞,用流式细胞仪检测线粒体膜电位变化并以PE/FITC值表示其变化。第三部分:机械通气诱发小鼠肺水肿过程中P120对NLRP3和线粒体的影响及调控机制将预先配置好的p120小干扰-脂质体混合物注入小鼠体内,进行p120基因敲除,然后对小鼠进行大潮气量机械通气;小鼠腹腔注射NLRP3抑制剂MCC950预处理1h后进行大潮气量通气。小鼠机械通气参数:潮气量为大潮气量28ml/kg,通气频率为60次/min,通气时间为4h,吸呼比1:2。分组:1.将C57BL/6小鼠分为对照组、机械通气组、DMSO处理组、MCC950处理+机械通气组;2.将C57BL/6小鼠分为对照组、机械通气组、p120基因敲除组、p120基因敲除+机械通气组。对照组:小鼠不进行机械通气。机械通气组:小鼠按上述参数实施大潮气量机械通气。DMSO处理组:向小鼠腹腔注射DMSO。MCC950处理+机械通气组:机械通气前1小时,向小鼠腹腔内注射一定量的MCC950,然后进行机械通气,按上述参数设置进行大潮气量机械通气。p120基因敲除组:将配制好的p120小干扰-脂质体混合物300 μ 1(含7.5nmo1 siRNA)注射入小鼠体内进行p120基因敲除,总共注射3次,小鼠肺组织p120敲除效率用Western Blot检测。pI20基因敲除+机械通气组:将配制好的p120小干扰-脂质体混合物300μ l(含7.5nmol siRNA)注入小鼠体内进行p120基因敲除,总共注射3次。进行机械通气,机械通气参数设置同机械通气组。1.将C57BL/6小鼠按各分组处理后的肺组织,Western Blot检测NLRP3、p120、β-catenin、TLR4、Phospho-NF-κ B、NF-κ B 和 ICAM1 的表达。2.用ELISA试剂盒定量检测小鼠支气管肺泡灌洗液中炎性因子IL-1 β、IL-6的含量。3.HE染色观察肺组织病理变化。4.取肺组织称量肺组织湿重/干重(Wet/Dry,W/D)。5.提取肺组织线粒体,流式细胞仪检测线粒体膜电位,以PE/FITC的值表示。6.肺组织Evans蓝染色检测肺损伤后通透性的变化。结果第一部分:机械牵张过程中NLRP3对线粒体和ROS的影响1.机械牵张过程中NLRP3对线粒体的影响。线粒体膜电位检测显示:与对照组相比,机械牵张组线粒体膜电位下降明显,表示线粒体损坏。NLRP3抑制剂处理细胞后再进行机械牵张,线粒体膜电位有所提高,线粒体损坏情况有所好转(P<0.05)。2.机械牵张对NLRP3的影响。Western Blot显示:与对照组相比,20%机械牵张刺激细胞4h,NLRP3表达增加。与牵张组相比,NLRP3抑制剂处理细胞后再进行机械牵张,NLRP3表达减少(P<0.05)。3.机械牵张过程中NLRP3对ROS的影响。细胞内活性氧水平检测显示:与对照相比,机械牵张组细胞内活性氧明显增加。NLRP3抑制剂处理细胞后再进行机械牵张,细胞内活性氧减少(P<0.05)。机械牵张能够导致线粒体损伤,NLRP3特异性抑制剂MCC950能够有效挽救机械牵张导致的线粒体损伤。第二部分:机械牵张过程中p120对NLRP3和线粒体的影响及调控机制1.机械牵张过程中p120对NLRP3的影响。Western Blot显示:随着p120 siRNA转染浓度的增高,一定范围内NLRP3呈剂量依赖性增加。与对照组相比,p120 siRNA组和机械牵张组NLRP3的表达增加,且这种趋势在对p120 siRNA转染组进行机械牵张4h后更加明显。相反,与对照组相比,p120 siRNA组和机械牵张组p120表达降低,且这种趋势在对p120 siRNA转染组进行机械牵张4h后更加明显;ELISA显示:NLRP3炎性小体的激活产物IL-1 β的变化趋势与NLRP3的趋势相同;免疫荧光共聚焦显示:NLRP3和Caspase-1的趋势与Western Blot相同(P<0.05)2.机械牵张过程中p120调节NLRP3的机制。(1)p120对TLR4通路的调节作用。Western Blot显示:与对照组相比,p120 siRNA组和机械牵张组中 TLR4、Phospho-NF-κB、NF-κB 和 ICAM1 均增加,且这种趋势在对p120 siRNA转染组进行机械牵张4h后更加明显(P<0.05)。(2)p120对ROS的影响。流式细胞仪检测细胞内活性氧水平显示:与对照组相比,p120 siRNA组和机械牵张组中ROS均增加,且这种趋势在对p120 siRNA转染组进行机械牵张4h后更加明显(P<0.05)。3.机械牵张过程中p120对线粒体的影响。电镜显示:与对照组相比,p120 siRNA组和机械牵张组中细胞内线粒体病变和空泡形成增多,线粒体肿胀,线粒体结构遭到破坏。且这种破坏趋势在对p120 siRNA转染组进行机械牵张4h后更加明显;流式细胞仪检测细胞内线粒体膜电位显示:线粒体早期功能改变。与对照组相比,p120 siRNA组和机械牵张组中线粒体膜电位降低,线粒体破环。且这种趋势在对p120 siRNA转染组进行机械牵张4h后更加明显(P<0.05)。p120抑制机械牵张导致的NLRP3激活。p120通过抑制TLR4通路和ROS激活来调节NLRP3。机械牵张过程中p120发挥保护线粒体结构和功能的作用。第三部分:机械通气诱发小鼠肺水肿过程中P120对NLRP3和线粒体的影响及调控机制1.机械通气对NLRP3和小鼠肺的影响。Western Blot显示:小鼠大潮气量机械通气4h,NLRP3增加;用抑制剂MCC950抑制NLRP3后再进行机械通气,与牵张组相比,NLRP3表达减少。HE染色和肺湿干比显示:小鼠大潮气量机械通气4h,肺组织损伤和肺水肿加重。抑制NLRP3后,肺组织损伤有所好转(P<0.05)。2.机械通气过程中p120对NLRP3的影响。Western Blot显示:与对照组相比,p120敲除组和机械通气组NLRP3的表达增加,且这种趋势在对p120敲除组进行机械通气4h后更加明显。相反,与对照组相比,p120敲除组和机械通气组p120表达降低,且这种趋势在对p120敲除组进行机械通气4h后更加明显。3.机械通气过程中p120调节NLRP3的机制。Western Blot显示:与对照组相比,p120敲除组和机械通气组中TLR4、Phospho-NF-K B、NF-κB和ICAM1均增加,且这种趋势在对p120敲除组进行机械通气4h后更加明显(P<0.05)。4.机械通气过程中p120对线粒体的影响。流式细胞仪检测肺组织内的线粒体膜电位显示:与对照组相比,p120敲除组和机械通气组中线粒体膜电位降低,线粒体破环。且这种趋势在对p120敲除组进行机械通气后更加明显(P<0.05)。5.机械通气过程中p120对小鼠肺水肿的影响。肺组织Evans染色,HE染色,肺湿干比均显示:与对照组相比,p120敲除组和机械通气组中出现肺组织损伤,肺水肿加重,且在对p120敲除组进行机械通气后肺组织损伤加重更加明显;ELISA显示:与对照组相比,p120敲除组和机械通气组中炎性因子IL-6和NLRP3炎性小体的激活产物IL-1 β增多,且在对p120敲除组进行机械通气后二者增多更加明显(P<0.05)。机械通气肺损伤中,p120通过抑制TLR4信号通路和ROS的激活来调节NLRP3,进而实现对线粒体的保护。结论VILI中线粒体与NLRP3炎性蛋白相互作用,机械牵张激活NLRP3并导致线粒体损伤,抑制NLRP3能减轻机械牵张导致的线粒体损伤;p120通过抑制TLR4通路及ROS激活以抑制NLRP3对线粒体的破坏,起到肺保护作用;线粒体和NLRP3炎性小体是防治VILI重要研究靶点。新论点本研究针对肺水肿发生的关键环节:肺泡膜通透性增加,炎性小体NLRP3激活,线粒体损伤进行在体和离体探讨,直接切断肺损伤的根源较以往研究更具临床价值和转化医学的可能性,为临床干预与治疗提供创新切实的思路。提出新的科学思维和干预措施:从炎性小体和线粒体角度,通过在体实验和离体实验分别探讨,提出以线粒体和炎性小体为核心,调控“细胞连接蛋白p120-NLRP3炎性小体-线粒体-肺泡膜通透性-VILI肺水肿”的机制研究,为VILI基础研究及临床防治提供了新靶点,为开发应用p120生物蛋白制品,炎性小体抑制及线粒体保护药物等转化医学开辟新途径。