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研究背景:铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是一种在自然界中广泛存在的革兰阴性条件致病菌,特别容易造成院内免疫功能低下患者感染。PA感染会导致多种急慢性疾病,如皮炎、肺炎、骨关节炎和泌尿系统炎症等,其中肺炎较为常见。目前临床上主要使用抗生素进行治疗,但因为PA具有很强的耐药性导致效果不佳,感染PA的肺炎患者死亡率就高达40.2%。此外,多重耐药和广泛耐药的PA菌株在全球范围内的流行,已经成为严峻的公共卫生问题,急需研究预防和控制PA感染的新策略。安全有效的PA疫苗是解决该问题经济和实用的手段,尽管已有60余种候选PA疫苗开展了动物实验或临床人体试验,但目前为止仍没有成功,其中原因可能是因为缺乏高效的抗原递送载体,导致疫苗免疫保护效果有限。高度保守的铜绿假单胞菌V抗原（PcrV）位于细菌Ⅲ型分泌系统的针尖处,是细菌分泌和转运毒素的核心组件。基于PcrV抗原的候选疫苗在抵抗肺部和烧伤创面PA感染中可提供有效保护。OprI是PA具有佐剂效应的外膜脂蛋白,与多肽或蛋白抗原融合后可提高其免疫原性,诱导强烈的体液免疫应答和细胞免疫应答。课题组在前期研究中将PcrV、OprI抗原经柔性Linker连接成融合抗原PcrV-OprI（rePO）,在动物实验中显示出良好的保护效果并获得了国家发明专利授权。通过纳米颗粒载体递送是增强抗原免疫原性和保护效果的有效途径之一。PA自身的热休克蛋白GroES和GroEL可自发组装成七聚体,形成粒径均一,生物相容性良好的纳米颗粒。因此,我们推测以GroES或GroEL为载体,递送rePO抗原可能诱导更强的免疫应答和保护效果,以期成功研制PA疫苗。研究目的:为了进一步提高rePO的免疫原性和保护效果,本研究以GroES或GroEL为载体,构建递送rePO的两种纳米颗粒疫苗rePO-GroES和rePO-GroEL,评价其保护效果并阐明免疫保护机制,为研制高效且安全的PA疫苗奠定基础。研究方法与结果:1.融合蛋白rePO-GroES的制备、理化性质及安全性检测从NCBI上获得PA（PAO1菌株）的GroES基因序列,通过In-Fusion基因融合的方法构建p ET-28a（+）-reGroES和p ET-28a（+）-rePO-GroES重组质粒。经表达、亲和层析后得到质量合格的reGroES和rePO-GroES蛋白。通过分子筛层析、动态光散射和电镜对reGroES和rePO-GroES进行理化性质检测,结果发现reGroES和rePO-GroES蛋白在溶液中的估算分子量分别约为70.0 k Da和315.5 k Da,形成分布均匀的纳米颗粒,粒径分别约为10.2 nm和28.2 nm。通过细胞溶血实验、CCK-8细胞毒性实验以及小鼠急性毒性评价实验对rePO-GroES进行体内外安全性评价,结果表明rePO-GroES在浓度为10～80μg/m L范围内未发生溶血反应,在浓度为50～200μg/m L范围内对DC 2.4细胞活率无明显影响。rePO-GroES免疫组和空白组小鼠的组织病理检测结果未见明显差异。以上结果表明rePO-GroES成功自组装为七聚体纳米颗粒且安全性良好。2.融合蛋白rePO-GroES对PA感染的免疫保护效果及机制研究为了探究rePO-GroES的免疫原性,肌注免疫小鼠后使用ELISA法检测血清中的特异性抗体效价和抗体亚型,结果表明rePO-GroES免疫组小鼠血清中抗rePO Ig G抗体效价显著高于单体rePO免疫组,且以Ig G1亚型为主（P＜0.05）。ELISPOT检测结果显示,rePO-GroES免疫组小鼠分泌IFN-γ、IL17A和IL-4的脾细胞数均显著高于单体rePO免疫组和对照组（P＜0.05）,这些结果提示rePO-GroES诱导的免疫应答水平强于单体rePO。使用急性铜绿假单胞菌肺炎模型评价rePO-GroES的免疫保护效果,发现rePO-GroES免疫组生存率显著高于rePO免疫组和空白组（P＜0.05）。此外,与单体rePO免疫组和空白组相比,rePO-GroES免疫组小鼠体重变化幅度小、感染程度轻、细菌定植量少、肺部炎症因子浓度和病理切片评分低（P＜0.05）,这些结果表明rePO-GroES的免疫有显著保护效果,优于rePO单体。3.融合蛋白rePO-GroEL的制备、理化性质及免疫原性检测从NCBI上获得PA（PAO1菌株）的GroEL基因序列,通过In-Fusion基因融合的方法构建p ET-28a（+）-reGroEL和p ET-28a（+）-rePO-GroEL重组质粒。经表达、亲和层析后得到质量合格的reGroEL和rePO-GroEL蛋白。通过分子筛层析、动态光散射和电镜对reGroEL和rePO-GroEL进行理化性质检测,结果发现reGroEL和rePO-GroEL蛋白在溶液中的估算分子量分别约为420.8 k Da和665.7 k Da,形成分布均匀的纳米颗粒,粒径分别约为22.7 nm和28.2 nm。这些结果提示reGroEL和rePO-GroEL均成功自组装为七聚体纳米颗粒。为了探究rePO-GroEL的免疫原性,肌注免疫小鼠后,我们分别使用ELISA和ELISPOT检测血清中特异性抗体效价和小鼠分泌IL-4、IL-17、IFN-γ的脾细胞数,结果显示rePO-GroEL免疫组小鼠产生的抗rePO Ig G抗体效价和分泌IFN-γ、IL17A和IL-4的脾细胞数均显著高于单体rePO免疫组和空白组（P＜0.05）。rePO-GroEL和reGroEL均可诱导高效价的抗reGroEL Ig G抗体,且二者无显著差异。这些结果表明与rePO单体相比,rePO-GroEL显著增强Th1、Th2和Th17型免疫应答。研究结论:本研究成功制备了粒径均一,生物相容性良好的rePO-GroES和rePO-GroEL自组装纳米颗粒疫苗,rePO-GroES的免疫对PA感染有显著保护效果,且优于rePO单体。rePO-GroES和rePO-GroEL均能增强针对rePO的Th1、Th2和Th17型免疫应答。纳米颗粒rePO-GroES和rePO-GroEL是良好的PA候选疫苗,为研制其他纳米颗粒疫苗提供了新思路。