拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者HBV DNA P区准种特点与复发的关系研究

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目的:探讨拉米夫定(LAM)治疗慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV DNA P区准种特点对达治疗终点停药后复发的影响。方法:研究对象:拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者43例(其中初治患者25例,经治患者18例),达到停药标准或延长疗程后停药,停药时行肝组织穿刺(肝穿)术,并分别于停药后半年内每个月和半年后每2个月检测HBVDNA、HBV血清学指标、ALT。收集治疗基线血清、达标停药肝组织和复发时血清。实验方法:水煮法提取血清rcDNA,特异性引物滚环扩增(RCA)提取肝细胞全长HBV cccDNA;采用相应引物PCR法扩增治疗前血清rcDNA、停药时cccDNA及复发时血清rcDNA的P基因区并用试剂盒胶回收P基因区产物,再准种克隆、测序,检测HBVDNAP基因区变异位点。分析治疗前血清HBV rcDNA、停药时肝细胞HBV cccDNA和复发时血清HBV rcDNA P基因区的准种特点与复发的关系。结果:(1) CHB患者基线血清rc DNA P区变异位点检出率最高的是N/H238T(14/30)、L/F/Q/R267H(12/30)、V278T(12/30)、D134E/I(11/30)、T222A(9/30),其中初治组基线血清rc DNA P区变异位点检出率最高的是:D134E/I(9/16)、L/F/Q/R267H(6/16)、N/H238T(6/16)、 V278T(6/16)、T222A(6/16),经治组基线血清rc DNA P区变异位点检出率最高的是:N/H238T(8/14)、L/F/Q/R267H(6/14)、V278T(6/14)、T222A(3/14);停药时肝细胞ccc DNA P区变异位点检出率最高的是L/F/Q/R267H (25/43)、V278T(18/43)、N/H238T(15/43)、D134E/I(14/43)、T222A(11/43),其中初治组停药时肝细胞ccc DNA P区变异检出率最高的是D134E/I (12/25)、L/F/Q/R267H(10/25)、V278T(8/25)、N/H238T(7/25),经治组停药时肝细胞ccc DNA P区变异检出率最高的是L/F/Q/R267H(15/18)、V278(T10/18)、N/H238T(9/18);复发时血清rc DNA P区变异位点检出率最高的是N/H238T(12/19)、 L/F/Q/R267H(10/19)、T222A(10/19)、V278T(8/19),其中初治组复发时血清rc DNA P区变异位点检出率最高的是N/H238T(6/10)、 L/F/Q/R267H(5/10)、T222A(5/10),经治组复发时血清rc DNA P区变异位点检出率最高的是:N/H238T(6/9)、V278T(6/9)、L/F/Q/R267H(5/9)、T222A(5/9);(2)复发患者肝细胞cccDNA P区N/H238T检出率高于未复发患者(P<0.05),未复发患者肝细胞cccDNA P区L/F/Q/R267H、D134E/I检出率高于复发患者(P<0.05),初治组未复发患者肝细胞cccDNA P区L/F/Q/R267H、D134E/I检出率高于复发患者(P<0.05),经治组复发患者肝细胞cccDNA P区N/H238T检出率高于未复发患者(P<0.05);(3)复发患者停药时cccDNA P基因区的准种复杂度比未复发者高(P<0.05),经治组复发患者停药时肝细胞cccDNA P区的准种复杂度比未复发者高(P<0.05);(4)经治组停药时肝细胞cccDNA和复发时血清rc DNA P区的准种复杂度均比初治组高(P<0.05);(5)复发组准种复杂度:复发时>达标停药时>治疗基线时,未复发组准种复杂度:达标停药时<治疗基线时。结论:(1)治疗前与达标停药时HBV DNA P基因区T222A、N/H238T变异优势株与复发相关;(2)治疗基线时HBV DNA P基因区V278T变异可能与复发相关;(3)经治患者停药时肝细胞cccDNA和复发时血清rc DNA P区的准种复杂度均比初治患者高;(4)停药时肝细胞cccDNA P区准种复杂度越高越容易复发;(5)D134E/I变异频率越高越不容易复发。
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