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近年来，抗生素的广泛使用导致细菌耐药性增强，给细菌感染性疾病的治疗带来了前所未有的挑战。抗菌肽(antimicrobial peptides，AMP)是一种具有抗菌活性的肽类抗微生物药物，作为动物和植物免疫防御系统产生的一种抵抗病源微生物的防御性物质，在天然免疫中起着重要的作用。目前，联合使用抗生素和抗菌肽来治疗严重的细菌感染性疾病成为新的治疗策略。使用转基因治疗技术在宿主体内特定组织表达抗菌肽，对细菌感染性疾病进行预防和治疗是目前最有前景的手段。CAMA-syn，由天蚕素（CA）的N端片段（1-8氨基酸残基）和蛙皮素（MA）的N端片段（1-12氨基酸残基）杂合优化而成，是一种具有广谱抗菌性能和低细胞毒性的新型抗菌肽。本研究拟采用基因治疗的策略，在特定的组织和细胞中高效表达抗菌肽CAMA-syn，使抗菌肽与细胞外微生物和被吞噬的胞内寄生菌“亲密接触”，克服抗菌药物不易到达靶点的缺点，在巨噬细胞和肺上皮细胞持续表达抗菌肽，达到高效杀灭感染微生物的目的。有关CAMA-syn在动物细胞，尤其是巨噬细胞和肺上皮细胞表达和抗菌能力的研究未见报道。为了增加机体的抗菌能力和减轻抗菌肽的副作用，用巨噬细胞和肺上皮细胞特异性表达抗菌肽CAMA-syn来抑制细菌感染具有一定可行性。本研究目的在于构建抗菌肽CAMA-syn的真核和腺病毒表达载体，在免疫系统的敏感组织和细胞中特异性表达抗菌肽CAMA-syn，通过体外和体内细菌感染实验，研究哺乳动物细胞表达的外源抗菌肽CAMA-syn对细菌的抑制和杀灭作用。主要的研究工作有以下几个方面：1.构建抗菌肽CAMA-syn真核表达载体，检测哺乳动物细胞中抗菌肽的表达和抑菌能力。构建真核表达载体，包括pMSP-CAMA-HA和pMSP-CAMA-GFP、pSPC-CAMA-HA和pSPC-CAMA-GFP，分别用巨噬细胞特异性启动子（MSP）和肺上皮细胞特异性启动子（SPC）调控表达由γ干扰素（INF γ）信号肽引导，并在C端携带GFP或者HA标签的抗菌肽CAMA-syn。转染巨噬细胞RAW264.7和肺上皮细胞A549，通过GFP标记、免疫荧光和免疫印记杂交等检测，证明抗菌肽CAMA-GFP和CAMA-HA融合蛋白的表达。收集表达CAMA-syn的巨噬细胞RAW264.7和肺上皮细胞A549的细胞裂解液和培养液上清进行抑菌实验，测试对革兰氏阴性菌Salmonella abortusovis和Pasteurella anatis、革兰氏阳性菌Staphylococcus hyicus和Streptococcus suis生长的抑制，通过菌落形成率和细菌生长曲线证明动物细胞表达的人工抗菌肽CAMA-syn具有一定的抑菌能力。2.将CAMA-syn基因片段装入腺病毒载体，经过包装和扩增得到高质量的特异性表达CAMA-syn的腺病毒颗粒。分别用巨噬细胞特异性启动子（MSP）和肺上皮细胞特异性启动子（SPC）调控抗菌肽CAMA-syn表达的组织特异性，同时在CAMA-syn基因后面连接IRES和GFP序列，使重组腺病毒表达抗菌肽CAMA-syn的同时也能够表达GFP，易于对CAMA-syn的表达进行观察和定位。收获重组腺病毒后，验证抗菌肽CAMA-syn基因成功整合。经过多次扩增，得到高纯度的浓缩腺病毒，测试病毒滴度、物理颗粒数和复制型病毒等指标均合格，达到进行感染细胞和动物模型的要求。3.用重组腺病毒感染动物细胞高效表达抗菌肽CAMA-syn，进一步检验动物细胞中抗菌肽的表达效率、抑菌作用及抗胞内寄生菌的能力。将重组腺病毒Ad-MSP-CAMA/GFP、Ad-SPC-CAMA/GFP和Ad-CMV-CAMA/GFP分别转染巨噬细胞RAW264.7、肺上皮细胞A549和对照组人胚肾细胞Phinex，确定最佳感染条件，通过GFP标签和RT-PCR检测到CAMA-syn的表达。收集表达抗菌肽CAMA-syn的巨噬细胞RAW264.7、肺上皮细胞A549和人胚肾细胞Phinex的细胞裂解液和培养液上清进行抑菌测试，菌落形成率和细菌生长曲线证明腺病毒转染动物细胞表达的抗菌肽CAMA-syn具有抑菌能力。同时发现，重组腺病毒表达的抗菌肽CAMA-syn能够降低胞内寄生菌沙门氏菌和减毒牛结核杆菌卡介苗BCG在细胞内的寄生能力。4，使用靶向表达抗菌肽CAMA-syn的重组腺病毒对胞内寄生菌感染动物模型进行基因治疗，发现动物细胞表达的CAMA-syn对胞内寄生菌感染具有一定的治疗作用。用气管注射法、尾静脉注射法和腹腔注射法给小鼠感染腺病毒颗粒，检测到GFP和抗菌肽CAMA-syn在心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏细胞中的表达以及相关免疫因子的激活和局部组织炎症反应，确定气管注射法是肺部感染腺病毒进行基因治疗的最佳方式。然后，通过给小鼠气管注入卡介苗（BCG）建立小鼠肺部感染胞内寄生菌的动物模型，分别使用重组腺病毒Ad-MSP-CAMA/GFP、Ad-SPC-CAMA/GFP和Ad-CMV-CAMA/GFP靶向性表达抗菌肽CAMA-syn，对感染动物模型进行基因治疗，发现不同组织特异性腺病毒对CAMA-syn的表达量略有不同，但是对胞内寄生菌BCG感染均具有一定的治疗作用。