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中国自1996年首次引进西伯利亚鲟(Acipenser baerii),由于其具有食谱广、易驯养、苗种培育成活率高、生长快、卵的营养价值高等优点,现已成为我国重要的鲟鱼养殖种类。雌鲟是价格昂贵鱼籽酱的生产者,但是鲟鱼的性腺发育和成熟都比较晚,而且第二性征不明显,给早期雌雄性别鉴定带来困难,这使其养殖成本增大,制约着鲟鱼养殖业的进一步发展。随着全球对鱼子酱的需求量日益增加,迫切需求鲟鱼雌性单性养殖技术的发展。鲟鱼的单性养殖不仅可以降低养殖成本,提高养殖效益,而且可以省去后期的雌雄鉴别繁琐程序。本研究主要利用组织学技术对西伯利亚鲟早期性腺发生、分化以及发育规律进行研究,确定在人工养殖条件下其性腺开始分化的时间及特征,为性别转化控制提供依据;利用投喂雌激素法诱导鲟鱼逆转,并比较不同的投喂剂量对鱼体的生长、血液生化指标、体内激素残留、组织病理、基因表达、性腺发育等影响,评价最适投喂剂量范围;利用雌核发育技术初步研究最佳精子紫外照射剂量、最佳染色体加倍开始处理时间以及微卫星技术对雌核发育个体的鉴定。主要研究结果归纳如下:
1.西伯利亚鲟早期性腺发生、分化以及发育
西伯利亚鲟孵化后3 dph(days post-hatch),原始生殖细胞(primordial germ cell,PGC)以单细胞的形式存在于仔鱼卵黄囊上方两中肾管之间,10dph时其迁移到背侧的腹膜上皮上,13dph时其沿腹膜上皮朝肾管区下方迁移,22dph时生殖嵴形成,31dph时原始性腺形成,40-60dph时原始性腺发育形成裂腔,PGCs沿腔壁排列,裂腔经过进一步发育并从背离腹膜上皮的底端慢慢愈合成实体,90dph时原始性腺中出现生殖上皮和性细胞,150dph时脂肪和血管增多,210dph时性腺开始分化,出现两种不同的表面结构,一种性腺切面的生殖上皮细胞呈柱状并且由两到三层伸长的细胞组成,在切面的边缘有明显的凹陷,生殖细胞成群的聚集在生殖上皮下为原始卵巢;另外一种性腺切面生殖上皮由单层细胞组成,边缘呈光滑型为原始精巢。利用组织学方法借鉴鱼类性腺分期标准,将西伯利亚鲟性腺分化为0期和Ⅰ~Ⅵ期。
2.投喂雌激素对西伯利亚鲟影响
采用饲料添加雌二醇开始投喂2月龄西伯利亚鲟幼鱼,至5月龄结束。在人工诱导西伯利亚鲟性逆转过程中,高剂量外源雌激素显著(P<0.05)抑制西伯利亚鲟幼鱼的日增重、肥满度、特定生长率;血清中血糖和总胆固醇浓度显著降低(P<0.05),而总磷含量显著升高(P<0.05);添加高剂量外源激素处理组中,利用组织病理学切片观察到西伯利亚鲟肾脏中近曲小管出现明显肿胀、管腔间质呈泡沫样纤维化现象;肝脏中可用肉眼观察到充血的红斑,组织病理学切片中肝细胞发生胀大,细胞界限不明显,细胞质中出现空泡,细胞核体积变小皱缩;以β-actin基因作为内参,采用半定量RT-PCR方法检测到热休克蛋白(HSP70)基因在激素处理组表达量显著提高(P<0.05),卵黄蛋白原(VTG)基因在空白组和对照组都未发现有表达,在激素处理组被诱导表达,并与处理激素呈剂量关系;在高剂量激素处理组中,性腺发育出现滞后现象,发育到8月龄时,雌性比例为76%;在激素残留研究中发现在利用激素处理过程中,空白组和对照组血清中未能检测出雌二醇(检测下限为8pg/mL),激素处理组中血液雌二醇浓度达到36.54±4.5pg/mL,但是停止投喂2个月后,血清雌二醇浓度减低到检测下限而未能检测出。
3.西伯利亚鲟卵雌核发育
利用紫外线照射灭活的史氏鲟(Aclpenser Schrenckii)精子诱导西伯利亚鲟卵雌核发育,通过37℃水温孵化热冲击休克法阻止第二极体的排出使染色体加倍,最终获得雌核发育二倍体苗种,并利用微卫星技术对苗种进行遗传分析。研究发现史氏鲟精子最佳照射剂量为36 mJ/cm2,最佳热休克开始处理时间为0.35τ0,雌核发育出现的单倍体发育畸形,尾巴弯曲,不能存活,筛选出的微卫星引物能成功的鉴别出雌核发育二倍个体遗传物质来源。