原发性肝癌是目前世界上发病广泛的恶性肿瘤之一,患者死亡率很高,目前已排在所有癌症死亡率的第三位。我国是肝癌的高发区,肝癌的新发和死亡患者占全世界50%以上,每年有近30万人死于肝癌。目前临床上针对肝癌的治疗方法仍然以手术切除、化疗栓塞、局部消融和放射治疗等手段为主,但从整体研究来看,上述治疗对延长患者的中位生存期并没有显著作用,而其伴随带来的一些毒副作用还可能加重患者病情。近年来,新兴的肿瘤免疫治疗手段日益受到重视,与传统疗法相比,其优势体现在治疗的个体化和较少的毒副反应。目前,研究较多的肿瘤免疫疗法主要包括肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigen, TAA)肽疫苗治疗和过继性免疫细胞治疗两大类,这些免疫治疗手段都是希望通过激发肿瘤患者体内有效的抗肿瘤免疫反应,进而达到杀灭肿瘤细胞的目的。具体来讲,抗肿瘤免疫反应又分为非特异性和特异性的两类,以细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer, CIK)为代表的过继性细胞治疗发挥广泛而非特异性的杀肿瘤作用,目前已在临床上得到一定应用,对部分患者起到了治疗作用；而以TAA肽疫苗和特异性T细胞抗原受体(T cell receptor, TCR)基因修饰的细胞治疗为代表的特异性抗肿瘤治疗则是以特定的TAA为靶点,希望能激发针对性的抗肿瘤免疫反应,强调肿瘤治疗的特异性和靶向性,是目前肿瘤免疫治疗的研究热点和新方向。TAA是一类与肿瘤的发生发展密切相关的抗原分子,其通常在细胞癌变时表达明显增高,而在正常组织中不表达或微量表达,这一特性使TAA在肿瘤治疗中可能具备潜在应用价值。目前认为,能用于特异性肿瘤免疫治疗的理想TAA应该具备以下三个特征：1.在大多数肿瘤中高表达而在正常组织中表达很少；2.其抗原肽能与主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex, MHC)分子有效结合；3.其能被体内的T细胞库所识别并能有效激活特异性T细胞抗肿瘤反应。近三十年来,研究者们已从60多种人类TAA中鉴定出超过170多种抗原肽,并通过实验鉴定获知它们能被MHC分子所呈递并被相应的T细胞所识别,被认为是肿瘤治疗的潜在靶点。虽然基于多种TAA的肽疫苗已开展了临床试验,但到目前为止,美国FDA仅在2010年批准了唯一一个用于治疗前列腺癌的疫苗Provenge,而其他绝大部分TAA肽疫苗的临床试验没有取得理想的效果,使特异性肿瘤免疫治疗的研究遇到了很大困难。近年来,随着研究的不断深入,对肿瘤疫苗疗效不佳的原因有了新的认识。由于肿瘤是由机体自身细胞发生恶性转化而形成的,TAA绝大部分为自身抗原,由于机体的中枢免疫耐受机制,体内能识别这些TAA的TCR高亲和力T细胞在发育早期即被免疫清除,体内存在的识别这些TAA的成熟T细胞,绝大多数为TCR低亲和力的naive T细胞,难以被TAA肽有效激活,这可能是目前肿瘤疫苗治疗困境的重要原因之一。要解决这一问题,在用于肿瘤特异性免疫治疗的TAA肽设计上需要有新的思路。其次,我们需要认识到,由于肿瘤患者体内的自身免疫功能本身处于一种异常状态,即使TAA肽的设计符合要求,单纯依靠其激发患者体内的特异性CTL抗肿瘤免疫反应也是比较困难的。有研究发现,利用肿瘤抗原在体外活化特异性CTL克隆,经扩增后再过继性回输患者体内可能是一条新的治疗途径。但目前认为,在MHC同型个体的T细胞库中,识别某特定抗原肽的抗原特异性T细胞比例仅为10-6～10-4,要在体外迅速诱导出针对TAA的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)克隆是一个较为困难的过程,同时后续的活化扩增也需要较长时间,这是影响后续过继性抗肿瘤功效的一大障碍。目前,研究较多的用于抗肝癌研究的TAA主要包括,甲胎蛋白(a-fetoprotein, AFP), NY-ESO1和MAGE-A等,虽然基于这些TAA的疫苗已经有部分被候选用于临床试验,但就已经报道的研究结果来看,绝大部分抗肝癌TAA疫苗的试验疗效并不突出。Survivin抗原属于凋亡抑制蛋白家族,它可以通过阻断细胞凋亡的Caspase-9途径抑制肿瘤细胞凋亡,研究发现Survivin广泛表达于各种恶性肿瘤,其中在90%的肝癌患者中高表达,但其在已分化的正常组织中几乎检测不到,因此被认为是具有较高潜在应用价值的TAA靶点。近年来,以Survivin抗原肽为背景的特异性抗肿瘤研究已在恶性黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌和尿路上皮癌等多种恶性肿瘤中开展,部分研究取得了较好的进展,但目前还未见到基于Survivin抗原肽的特异性抗肝癌肿瘤疫苗研究的实验报道。本研究着眼于上述影响肿瘤特异性免疫治疗的相关问题开展实验设计,在综合国外相关领域的最新研究进展及本研究团队的前期研究成果基础上,我们以Survivin抗原为对象开展针对肝癌的特异性抗肿瘤实验工作,整个研究分三部分进行,首先运用生物信息学技术分析可能的Survivin抗原CTL表位,并利用抗原肽点突变技术提高Survivin抗原肽与MHC分子及TCR分子的结合力,希望解决普通TAA肽免疫原性低下的问题；接着我们利用筛选获得的突变Survivin抗原肽刺激T细胞活化,建立反应性CTLs克隆,希望能解决TAA肽难以有效激活癌症患者体内主动免疫反应的问题；最后我们对突变肽诱导反应性CTL克隆的TCR基因家族表达谱变化进行分析,鉴定并克隆出反应性CTL克隆的TCR基因,将其转染外周血来源的T细胞,希望能通过TCR转基因技术在短时间内获得较多数量的具有抗肿瘤反应性的效应T细胞,为打破肿瘤免疫耐受,提高机体抗肿瘤反应能力提供一种肿瘤特异性免疫治疗新方案。一、点突变Survivin抗原表位的生物信息学分析在抗肿瘤免疫反应中,CTLs通过其表面的TCR分子特异性识别肿瘤细胞MHC-I类分子(在人类为HLA-I类分子)递呈的抗原表位肽进而杀伤肿瘤细胞,因此在肿瘤疫苗的设计中,抗原表位设计的好坏直接决定着抗肿瘤免疫反应的效果。有研究报道,在我国肝癌高发区肝细胞癌患者中有超过50%的比例为HLA-A2分子表达阳性,表明HLA-A2基因型可能与肿瘤密切相关,而成为当地癌症发生的一个易感因素,因此本论文所设计的Survivin抗原表位为HLA-A2所递呈。在本部分研究中,我们的目的是利用生物信息学分析及实验验证寻找理想的候选点突变Survivin抗原表位肽。首先,利用两个经典的CTL抗原表位在线预测系统BIMAS(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla bind/)和SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)对野生型Survivin抗原全长氨基酸序列的HLA-A2限制性9氨基酸表位肽进行了预测评分,我们筛选了两个预测系统评分前二十位的表位肽进行分析,寻找评分较低且氨基酸残基第二位不是V、L、I、M、T等疏水性氨基酸的表位肽,最终确定Sur79(KHSSGCAFL)作为候选野生型Survivin表位肽进行氨基酸位点的人工突变,通过比较突变前后的在线评分变化情况,鉴定出两条用于实验的Survivin点突变肽Sur79L2与Sur79M2。我们接着进一步体外合成了五条Survivin表位肽,利用T2细胞进行MHC-肽结合稳定性实验,结果显示野生型表位肽经突变后与HLA-A2分子的亲和力大大提高,证实突变肽Sur79L2、Sur79M2与MHC分子的结合稳定性显著提高,与生物信息学在线预测结果相一致。该部分研究获得了用于后续实验的点突变Survivin表位肽Sur79L2和Sur79M2。二、点突变Survivin表位肽诱导的抗肝癌特异性CTLs克隆的建立CTL是具有细胞毒作用的效应性CD8+T细胞,其可以通过分泌穿孔素、颗粒酶(Granzyme B, GzmB)等物质直接杀伤靶细胞,也可以通过Fas/FasL途径诱导靶细胞凋亡。CTL杀伤力较强,可反复杀伤靶细胞,而且在杀伤靶细胞的过程中本身不受损伤,其杀伤过程具有有高效性,抗原特异性和自身MHC限制性、与自然杀伤细胞构成机体抗肿瘤免疫的重要防线。在本部分研究中,我们的目的是利用之前设计并合成的点突变表位肽Sur79L2和Sur79M2在体外诱导肽反应性CTLs,并验证其针对肝癌细胞系的细胞毒作用。我们利用密度梯度离心法从一位高表达Survivin抗原的]HLA-A2+肝癌患者腹水中分离单个核细胞,单个核细胞贴壁后体外诱导分化为树突细胞(Dendritic cell, DC),体外诱导10天左右利用流式细胞仪检测成熟DC的表面标记分子表达情况,备用。向腹水来源的肿瘤相关淋巴细胞(tumor-associated lymphocytes, TAL)中分别加入10mM的不同合成表位肽进行首轮刺激培养14天,第二轮刺激加入10mM的抗原肽、300IU/mL的重组人IL-2及诱导成熟的DC,继续培养12天。利用ELISPOT法检测肽刺激后能有效分泌干扰素-γ(Interferon-γ, IFN-γ)的活化淋巴细胞数量；免疫磁珠法分离肽诱导的CD8+T细胞作为效应细胞,以负载合成表位肽的T2细胞作为靶细胞,进行细胞毒试验；将肽刺激的TAL与肝癌细胞系共孵育后,收集淋巴细胞上流式细胞仪检测CD8+T细胞内GzmB的表达情况,倒置相差显微镜观察肝癌细胞形态学变化情况,CytoTox96(?)试剂盒检测CTL对肝癌细胞的裂解情况。结果显示点突变肽Sur79L2和Sur79M2均能有效刺激腹水来源的TAL活化分泌IFN-γ,并能对负载野生肽及突变肽的T2细胞发挥细胞毒作用；与肝癌细胞系共孵育后,能以MHC-Ⅰ类限制性方式有效杀伤肝癌细胞,CD8+T细胞能有效分泌GzmB,肝癌细胞系出现凋亡或坏死样表型变化。该部分研究证实利用点突变Survivin表位肽可以在体外诱导出特异性杀伤肝癌细胞系的CTLs克隆。三、基于点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选与抗肝癌功能初步研究TCR分子是T细胞表面的跨膜蛋白,其对抗原肽-MHC复合物的特异性识别为T细胞活化提供第一信号,是T细胞发挥免疫功能的最重要分子之一。根据TCR的类型不同,可分为TCRαβ+T细胞和TCRγδ+T细胞,其中TCRαβ+T细胞占T细胞总数的95%以上,而TCRαβ+CD8+T细胞是发挥重要抗肿瘤免疫功能的一类CTLs。研究发现,肿瘤患者体内可有效识别肿瘤抗原的TCRαβ+T细胞缺失是导致肿瘤免疫耐受发生的重要原因之一。近年来,有研究证实特异性TCR基因转导技术能赋予普通成熟T淋巴细胞新的特异性杀伤抗原靶细胞能力,TCR基因修饰的过继性抗肿瘤免疫治疗也成为研究热点。在本部分研究中,我们的目的是从点突变肽体外诱导的CTLs中筛选出具有显著克隆增殖特点的TCR基因,并将其转染健康人T淋巴细胞验证其对肝癌细胞系的识别杀伤能力。我们首先利用流式细胞术对前期点突变表位肽Sur79L2和Sur79M2体外刺激诱导的CTLs进行TCRVβ基因亚家族表达谱检测,与刺激前的TCRVβ基因亚家族表达谱相比较,寻找比例发生显著性升高的TCRVβ基因亚家族,接着利用GenomeLab GeXP遗传分析系统对肽刺激后CTLs的TCRVα和TCRVβ基因表达情况进行精细分析,筛选出现明显单克隆扩增的TCR基因,将单克隆扩增的TCR基因全序列通过PCR法克隆到T载体上,挑取多个克隆测序,将测序结果进行分析比对,重点比对TCR基因CDR3区的序列差异,寻找多个克隆出现相同CDR3区基因序列的TCR基因。将筛选获得的TCR基因插入腺病毒表达载体中,包装出具有感染能力的腺病毒转染HLA-A2+的健康人T淋巴细胞,利用流式细胞术检测转染后特异性TCR基因的表达水平,将TCR基因修饰的T细胞与肝癌细胞系共孵育,验证其对肝癌细胞系的细胞毒作用。结果显示,点突变表位肽Sur79L2诱导的CTLs中TCRVβ9和TCRVβ2两个基因亚家族出现比例升高,而点突变表位肽Sur79M2诱导的CTLs中TCRVβ7和TCRVβ16两个基因亚家族比例升高,进一步的GeXP检测结果显示在Sur79L2诱导的CTLs中出现一个TCRVα24和TCRVβ9基因的单克隆扩增,而在Sur79M2诱导的CTLs中未发现明显的TCR基因单克隆扩增,进一步通过测序比对鉴定出一个针对Sur79L2的TCR基因TCRa24β9,利用腺病毒传输系统将该TCR基因转染HLA-A2+健康人外周血PBMC,将TCR基因修饰的T淋巴细胞与肝癌细胞系共孵育,可观察到显著的细胞毒作用,其杀伤表现为HLA-A2限制性。该部分研究证实利用我们筛选获得突变肽特异性TCRα24β9基因转染修饰健康人T细胞能够实现对肝癌细胞系的有效杀伤。综上所述,本研究利用生物信息学分析结合试验验证筛选到两个与HLA-A2分子结合能力显著提高的点突变Survivin表位肽Sur79L2和Sur79M2,将这两个点突变肽体外刺激活化一名肝癌患者腹水来源的TAL,可获得具有特异性识别杀伤能力的CTLs,并通过进一步的筛选和鉴定获得了针对Sur79L2的特异性TCRα24β9基因,将该TCR基因转染健康人T细胞后,证实TCR基因修饰的T细胞获得了特异性杀伤肝癌细胞系的能力。本研究有望为为今后开发基于突变抗原肽的特异性T细胞过继性肿瘤治疗新方法和新型靶点治疗抗肿瘤TCR基因药物提供有益的参考与借鉴。