实验目的　　疟疾广泛分布于热带和亚热带地区，每年造成300多万人感染，并导致60多万人死亡。脑型疟疾(CM)是恶性疟原虫感染最严重的并发症，且是5岁以下儿童死亡的主要原因。导致人类CM发生的机制尚不十分清楚，疟原虫寄生的红细胞(PRBCs)粘附至脑血管内皮细胞引起脑微血管机械性梗阻被认为是导致CM的病理机制。此外，以高水平炎性细胞因子为特点的过度炎症反应也被认为有助于CM的发生。炎性细胞因子上调脑血管内皮细胞黏附分子如ICAM-I和VCAM-1的表达，进一步增强细胞粘附和PRBCs在大脑的沉积。更好地了解CM的发生机制和明确CM有效的辅助治疗策略是亟待解决的重要课题。　　伯氏疟原虫（PlasmodiumbergheiANKA，P.bANKA）感染的鼠疟模型疾病过程与P.f疟疾感染的临床表现有许多共同之处，是研究人类疟疾疾病的最佳模型。研究表明，CM是脑血管内感染红细胞(parasitizedredbloodcells，pRBC)的黏附和细胞因子与效应细胞介导的宿主强烈前炎症应答的综合效应。相关研究表明活化T细胞介导的免疫应答参与疾病诱导，并且CD4+T细胞和CD8+T细胞均有利于脑病变发生。事实上，Th1型免疫应答在控制虫血症方面发挥关键作用的同时也促进CM发生。　　维生素D(Cholecalciferol，VD)是一种脂溶性维生素，暴露于紫外线或添加饮食后由皮肤合成。VD除了其经典的调节骨和钙磷代谢，在先天免疫和适应性免疫系统也有明显的调节功能。VD的免疫调节功能，特别是对Th1型反应的抑制作用，促使我们进一步研究VD在实验性脑型疟疾(ECM)中的作用。在啮齿类动物疟疾模型中，有报道表明在伯氏疟原虫感染小鼠之前口服给予VD预防性治疗两周，可以降低小鼠感染率和延长生存期。然而，最近的一项研究表明，每周三次腹腔注射0.5μg/kgVD，对感染PbA的野生型小鼠没有影响。为此，我们系统地研究了VD对ECM模型（P.bANKA感染C57BL/6小鼠）的免疫调节效应及其相关机制，旨在为疟疾的有效防治提供新的理论依据。　　实验方法　　1、收集患者血清　　从缅甸东北部村庄采集56个无疟疾感染并发症的发热病人（27例恶性疟和29例间日疟）。此外，10名健康志愿者作为对照组。获得书面同意后，用内壁覆有EDTA的真空采血管采集每个志愿者1ml的静脉血。将血液以1000×g，5分钟离心，收集血清，将其贮存在-80℃待检测VD。根据制造商的说明，使用25(OH)D3的ELISA试剂盒(ImmundiagnostikAG,Bensheim，Germany)，测定每个志愿者血清中的25(OH)D3的水平。样品重复测定，取平均值。　　2、实验动物处理、感染及原虫血症观察　　VD处理:C57BL/6小鼠随机分为6组:正常小鼠未感染(uninfected)，两个PbA感染对照组(PbA)，PbA感染前补充VD组(VD+PbA)，PbA感染后补充VD组(PbA+VD)，和正常小鼠未感染，但给予VD治疗作对照。VD+PbA组小鼠在PbA感染之前连续4天，每日灌胃给予VD(50μg/kg)，而PbA+VD组小鼠在PbA感染48h之后开始连续4天，每日灌胃给予VD(10μg/kg、50μg/kg、250μg/kg)。两对照组在VD+PbA和PbA+VD给药的相同时间点给予相同体积的大豆油作为对照。在感染的第5天，收集血清，并使用25(OH)D3的ELISA试剂盒检测25(OH)D3的含量。　　小鼠感染:经腹腔感染1×106P.bANKA寄生的红细胞(pRBC)，感染不同时间的小鼠经尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，镜检计数红细胞感染率。　　3、小鼠血脑屏障通透性检测　　(1)于小鼠感染后第5天将各组小鼠静脉注射200μl2％伊文思蓝染料(2％Evansbluedye，EB，sigma公司)。　　(2)1h后，心脏灌注生理盐水至流出清亮液体为准，然后取脑，拍照。　　(3)将各组小鼠的脑放入离心管中，管内加入1ml甲酰胺（sigma公司），37℃孵育48h。　　(4)将各管取出，3000rpm离心15min，取上清液200μl，放于96孔板中。　　(5)630nm检测OD值。　　4、HE染色和免疫组化　　PbA感染后第5天开始出现神经症状，对每个实验组的五只小鼠进行组织学检查。用×400显微镜观察ICAM-1，VCAM-1-，和CD36阳性血管，计数每只小鼠20个视野阳性血管的数量。小鼠大脑被固定在4％多聚甲醛中，然后石蜡包埋和切片，免疫组化(IHC)方法如下:　　(1)石蜡切片，常规脱蜡脱水。　　(2)3％H2O2（无色液体）室温孵育10分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。　　(3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟。　　(4)抗原修复:枸橼酸钠缓冲液高压修复方法。自然冷却，再用PBS3分钟×3次。　　(5)血清封闭:37℃孵育30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。　　(6)滴加适当比例稀释的一抗，4℃过夜（最好复温）。PBS冲洗，3分钟×5次。　　(7)滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育1小时。　　(8)PBS冲洗，3分钟×5次。　　(9)滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30分钟。　　(10)PBS冲洗，3分钟×5次。　　(11)显色剂显色（DAB等）。　　(12)自来水充分冲洗终止显色。　　(13)可进行复染，脱水，透明。　　(14)封片剂封片。　　5、Real-timeRT-PCR　　脑组织TotalRNA的提取及反转录:用Trizol按照说明书提取脑组织RNA，然后使用分光光度计测定浓度。用PrimeScriptTMRT试剂盒（Takara公司）去除基因组DNA，将RNA反转录成cDNA。反转录体系为10μl，含有PrimeScriptTM缓冲液，PrimeScriptTMRT酶混合物，oligodT引物(50μM)和随机引物两种(100μM)及500ng总RNA。Real-time反应:用得到的cDNA作为模板和特定引物进行PCR反应。使用SYBR(R)PremixExTaqTM试剂盒在ABI7500(ABI，USA)机器上进行定量PCR（Takara公司）。反应条件如下:95℃预变性30秒，40个PCR循环（95℃5秒和60℃30秒）。采用2-△△CT法量化VD处理组与对照组的相对基因表达。　　6、脾细胞培养　　无菌取出感后第0、3、5天小鼠脾脏，用10％FCS-RPMI1640培养液制成细胞悬液，1500rpm离心10min，用0.17MNH4Cl裂解红细胞，RPMI1640洗涤两次。以含10％FCS-RPMI1640调整脾细胞终浓度为1×107/ml，于24孔培养板中加入细胞悬液，500μl/孔，每组设2个复孔。于37℃培养48h。350g室温离心10min，收集上清，-80℃保存，待IFN-γ、TNF和IL-10检测。　　7、ELISA检测　　用ELISA试剂盒分别检测血清和脾细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α及IL-10的分泌水平。酶标仪测定450nm处OD值。实验操作按照试剂盒说明书进行，结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，应用SoftMaxPro4.3.1Ls软件分析，计算细胞因子含量(pg/ml)。　　8、流式细胞术　　脾脏流式细胞术:　　无菌取出感染前（第0天）和感染后第3、5天小鼠脾脏，常规方法制备脾细胞悬液，用0.17mol/LNH4C1裂解红细胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640调整脾细胞终浓度为1×107/ml。DCs检测:每份样品用抗CD11c-FITC单抗、抗CD11b-PE单抗、抗CD45R/B220-PerCP单抗和抗MHCⅡ-APC单抗进行四色分析，另设阴性对照管，在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，再加入抗CD11c-FITC单抗、抗CD11b-PE单抗和抗CD45R/B220-PerCP单抗进行表面染色，离心去上清后，用0.5mlPBS重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。TLR9检测:每份样品应用FITC标记的抗小鼠CD11c单抗和Biotin标记的抗小鼠TLR9单抗进行双色分析，另设单标CD11c单抗和TLR9单抗对照管。每管预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体2μl。然后用抗CD11c-FITC单抗进行表面染色，4℃30min。每管加入2ml含2％FCS的PBS，1500rpm离心5min，弃上清，洗涤两次。然后加入固定透膜夜250μl，4℃孵育1h。再加2ml1×wash固定透膜洗液，1500rpm离心5min洗涤1次，弃上清。加入抗-TLR9-BiotinmAb进行胞内标记，4℃孵育30min。每管加入2ml含2％FCS的PBS，1500rpm离心5min，弃上清，洗涤两次。加入抗-Streptavidin-PE进行胞内标记，4℃孵育30min。洗涤两次，每管加入200μl2％多聚甲醛固定液重悬，流式细胞仪进行检测。TLR4检测:每份样品用抗CD11c-FITC单抗和抗TLR4-PE单抗双色分析，另设阴性对照管。在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，离心去上清后，用0.5ml细胞染色缓冲液重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。Th1检测:每份样品预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，刺激5h后，再加入抗-CD4-FITC单克隆抗体，固定透膜后加入抗T-bet-PerCP和IFN-γ-PE单克隆抗体，染色30分钟。离心去上清后，用0.5ml细胞染色缓冲液重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。Tregs检测:每份样品用抗CD4-FITC和抗CD25-PE单抗进行表面染色，固定透膜后，用抗Foxp3-APC单抗进行胞内染色，用含1％FCS的PBS洗涤两次并悬浮于0.5mlPBS中，流式细胞仪进行检测。　　脑组织流式细胞术:　　将小鼠处死，取出脑，用150目筛网研磨脑。然后加入到5ml含有100U/mlⅣ型胶原酶的RPMI1640中，42℃水浴45分钟。300g离心10min，收集细胞沉淀，用30％Percoll重悬沉淀，然后加入到70％Percoll上层（用PBS配制），515g室温离心30min。收集中间层，加入10mlPBS300g离心10min，然后标记相应的抗体:FITC-CD4、PerCP-CD8和APC-CD3。4℃染色30min，PBS洗涤细胞两次，上机检测，Flowjo软件分析。　　9、统计学分析　　使用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，标本采用独立样本t检验比较分析组内和组间均值差异，采用Kaplan-Meyer方法进行生存期分析。P＜0.05为显著差异。　　实验结果　　1、VD处理显著升高P.bANKA感染C57BL/6小鼠血清中25(OH)D3水平　　在感染后的第5天，正常对照组小鼠和PbA感染的小鼠VD水平相同。与未处理PbA感染组比较，两个VD治疗组25(OH)D3水平均显著增高。我们还比较了健康人和疟疾感染者血清中25(OH)D3水平。个体之间VD水平差别很大。健康人与急性恶性疟和间日疟患者25(OH)D3的均值(Kruskal-Wallisx2=3.13;P=0.2086)和平均对数转换值(F=0.336;P=0.7160)没有显著差异。疟疾患者血清25(OH)D3水平与健康对照组比较，无统计学差异。　　2、VD处理显著防止P.bANKA感染C57BL/6小鼠CM的发生　　对照组小鼠在感染后第5-6天开始出现明显的脑疟症状（如抽搐，皮毛竖起，颤抖，肢体瘫痪，痉挛，昏迷等神经学症状），第6-7天小鼠开始死亡，在第11天全部老鼠死亡。对照组死亡的小鼠原虫血症水平相对较低(＜12％)。给予大豆油的PbA感染组小鼠和未经处理的感染对照组有相同的症状（病理学，生存期，或原虫血症）。PbA感染前或后给予VD(50μg/kg)治疗均减少早期死亡率而且所有VD治疗的小鼠存活时间超过感染后11天。相反，VD(50μg/kg)治疗组小鼠在感染3周后因贫血和原虫血症死亡。出入意料的是，感染后补充VD有一个优势，PbA+VD组小鼠存活时间长于VD+PbA组。此外，PbA+VD组小鼠原虫血症水平低于VD+PbA组。因此，我们对PbA+VD组的病理和免疫学进行进一步的分析。　　3、VD处理显著改善实验性脑疟的病理改变　　在小鼠感染后第5天，当小鼠出现脑疟症状时取脑。与正常小鼠相比，组织学检查显示，PbA+VD组显微镜下每个视野白细胞沉积的血管数明显低于对照组。免疫组化发现，PbA+VD组微血管内皮细胞表达的VCAM-1，ICAM-1和CD36明显少于对照组。同时，PbA组血脑屏障的完整性破坏明显，有较高水平的EB外渗。相比之下，VD治疗明显减少脑组织的EB渗出。　　4、VD处理显著减少T细胞向脑组织迁移　　在小鼠感染后第5天，分离脑单核细胞并检测CD8+和CD4+T细胞的量。与未感染的正常小鼠相比，PbA感染CD8+和CD4+T细胞的量显著增多。与此相反，PbA感染后VD治疗组小鼠脑T细胞群的数量与未感染正常小鼠比较没有显著差异。为此，我们还对VD治疗组和对照组脑组织CXCL9和CXCL10的mRNA表达进行比较。在感染后第5天，VD治疗显著降低脑组织中趋化因子的表达。　　5、VD抑制Th1细胞免疫应答　　PbA感染小鼠第5天血清中IFN-γ和TNF水平显著增加，脾细胞培养上清中的这些细胞因子也显著增加。而VD治疗组血清和脾细胞培养上清中的这两种细胞因子水平明显降低。此外，与对照组比较，VD治疗组小鼠在感染后第5天脑组织中IFN-γ和TNF的mRNA表达显著降低。同时，与感染前相比，对照组Th1型细胞（CD4+T-bet+IFN-γ+细胞）的数量在感染后第3、5天显著升高。然而，在感染后第5天，VD治疗组小鼠脾细胞中Th1型细胞所占比例明显降低。　　6、VD处理提高Tregs数量并增加IL-10分泌　　在小鼠感染后第3天，与对照组比较，PbA+VD组Tregs的数量显著升高。此外，与对照组相比，PbA+VD组脾细胞培养上清中IL-10的分泌水平升高。同时，感染后第5天PbA+VD组小鼠血清中IL-10水平也显著增加。　　7、VD下调DCs数量　　在小鼠感染后第5天，对照组髓样DCs(mDCs)和浆样DCs(pDC)数量明显高于PbA+VD组。在感染后第5天，PbA+VD组DCs共刺激分子MHCⅡ表达降低。此外，感染第5天，PbA+VD组DCs表面分子TLR4和胞内TLR9的表达也降低。　　结论　　我们的研究表明，VD在ECM发生过程中具有抗炎症作用。更重要的是，我们的结果证实VD通过影响脾脏DCs数量，减少炎症细胞因子IFN-γ，TNF以及趋化因子CXCL9，CXCL10和粘附分子ICAM-1，VCAM-1，CD36的表达，进而降低CD8+T细胞在脑中的积聚，并且改善血脑屏障的完整性，最终防止脑疟的发生。