甲醛炎性痛时脊髓后角HO-1蛋白表达增加对神经元凋亡的影响

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目的:内源性一氧化碳(Carbon monoxide, CO)是继一氧化氮(Nitric oxide, NO)后被发现的又一重要气体信号分子和神经递质,在人和哺乳动物的生理及病理过程中具有重要的生物学功能。血红素氧合酶(Heme oxygenase, HO)是血红素代谢的限速酶,广泛分布于人体各组织器官,其催化血红素(Heme)降解为CO、铁及胆绿素(很快被还原成胆红素)。HO-1为HO的一种亚型,正常时在神经系统表达较低,但可被多种因素所诱导。本室以往研究发现,甲醛炎性痛可诱导脊髓后角NO产生增多,进一步的研究发现,NO增加是甲醛炎性痛诱导脊髓神经元凋亡的重要机制之一。已有一些研究发现,HO/CO系统参与了脊髓伤害性信息的传递过程,结扎坐骨神经引起的神经损伤可诱导脊髓水平HO蛋白表达增多,CO产生增多,但甲醛炎性痛引起的伤害性信息传入是否会诱导脊髓HO-1表达发生改变以及HO-1表达改变在甲醛炎性痛诱导的神经元凋亡过程中发挥何作用尚未见相关报道。本实验应用Western blotting方法首先观察了甲醛炎性痛大鼠脊髓后角HO-1蛋白表达的变化,而后采用鞘内注射HO-1抑制剂锌原卟啉Ⅸ(Zinc Protoporphyrin IX, ZnppⅨ),观察HO-1对炎性痛大鼠脊髓神经元凋亡的影响,阐明HO-1表达改变的意义。1甲醛炎性痛诱导脊髓HO-1蛋白表达改变25只健康雄性Sprague-Dawley大鼠,体重260~280g,随机分为5组,分别为正常对照组(Control组)、甲醛6h组(F6h)、甲醛12h组(F12h)、甲醛24h组(F24h)、甲醛72h组(F72h),每组5只动物。Control组不做任何处理,直接断头取材。甲醛各时间点组动物均于足底注射甲醛后观察自发疼痛反应,然后于不同时间点断头取腰5(L5)脊髓后角,用Western blot方法分别检测左、右两侧脊髓后角HO-1蛋白的表达。结果发现:大鼠右足底注射甲醛后,即刻出现舔、摇、和抬高注射足等自发痛行为,这些自发性痛反应呈双时相性,持续1 h以上,且注射部位出现红、肿等明显的炎症反应。Western blot检测结果发现, Control组大鼠脊髓后角左、右两侧的HO-1蛋白条带面积较小,染色较浅,表明正常大鼠HO-1蛋白有一定量的基础表达。足底注射甲醛后各时间点组与Control组相比,HO-1蛋白表达均明显上调,表现为HO-1蛋白条带增宽,HO-1与β-actin积分光密度(integrated optical density, IOD)比值升高;其中以F24h组HO-1表达升高最为明显,达到峰值。足底注射甲醛后72小时,脊髓后角左、右两侧的HO-1表达较F24 h组明显降低,但仍高于Control组水平。各时间点左、右两侧脊髓后角比较,HO-1蛋白表达无明显差异。2 HO/CO在甲醛炎性痛诱导大鼠脊髓神经元凋亡中的作用健康雄性Sprague-Dawley大鼠30只,体重260~280克,随机分成5组,分别为正常对照组(Control组)、甲醛组(F组)、甲醛+溶剂DMSO组(F+DMSO组)、甲醛+ZnppIX50μg组(F+50μg Z组)、甲醛+ZnppIX100μg组(F+100μg Z组),每组6只动物。甲醛+DMSO组和甲醛+各剂量ZnppIX组动物均预先鞘内注射DMSO或HO-1抑制剂ZnppIX溶剂,30分钟后足底注射甲醛,于注射甲醛后72小时断头取脊髓腰5(L5)节段,采用流式细胞技术检测脊髓神经元凋亡率。结果发现:与F组比较,F+DMSO组动物自发痛反应程度无明显改变,表明鞘内注射溶剂DMSO对动物自发痛反应无明显影响;在F+50μg Z组和F+100μgZ组动物中观察到,预先鞘内注射50μg或100μgZnppIX,均可使甲醛诱导的自发痛反应程度明显降低,并且鞘内注射ZnppIX对自发痛反应的抑制程度随着ZnppIX剂量增大而更加显著。流式细胞技术结果显示:Control组大鼠脊髓神经元凋亡率较低。与Control组比较,F组大鼠脊髓神经元凋亡率明显升高,F+DMSO组与F组相比,大鼠脊髓神经元凋亡率无明显差别,表明鞘内注射溶剂DMSO对大鼠脊髓神经元凋亡率无明显影响;F+50μg Z组大鼠和F组大鼠比较,脊髓神经元凋亡率无明显差异,但增大ZnppIX剂量,预先鞘内注射100μg ZnppIX,则可使F+100μg Z组大鼠脊髓神经元凋亡率明显升高;这一结果表明,甲醛炎性痛诱导的HO/CO系统活动增强可以抑制神经元凋亡过程。3结论甲醛炎性痛可诱导脊髓后角H0-1表达增多,注射甲醛后24小时H0-1表达增多最为明显。甲醛炎性痛诱导的脊髓后角H0-1表达增多具有抑制甲醛炎性痛诱导神经元凋亡的作用。
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