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前言:
目前恶性肿瘤已成为危害人类生命健康最重要的疾病之一,据世界卫生组织报告显示,全世界每年约1300万癌症新增患者,死亡约760万,已成为威胁人类生命健康的第二大杀手,因此寻找有效的癌症治疗手段已成为必然。
在恶性肿瘤的治疗中,化学治疗占重要地位,包括使用天然的或化学合成制剂来抑制肿瘤,而在化学合成的抗肿瘤药物中绝大多数是以天然植物为先导化合物的药物。因此,从天然植物成分中筛选抑制肿瘤细胞生长的药物,已成为目前寻找抗肿瘤药物的一个理想途径。
云南民间中草药瓦草为石竹科绳子草属植物黏萼绳子草SileneviscidulaFranch.的干燥根,具有清热、利湿、通淋的功效,民间主要用于治疗肺热咳嗽、湿热淋病、风湿骨痛、头痛、牙痛、脘腹疼痛、跌打伤痛、产后宫缩痛等症,但目前尚未见瓦草的化学成分及抗肿瘤药理作用的相关报道。
本研究对沈阳药科大学从瓦草乙醇提取物中首次分离鉴定的16个三萜皂甙类化合物和2个蜕皮甾酮类化合物的抗肿瘤活性进行了初步筛查,发现其中3种成分具有不同程度的肿瘤细胞生长抑制作用,经药物结构分析证实,这三种化合物在结构上均为三萜皂甙类化合物,已有研究表明,三萜皂甙类化合物,具有化学预防、诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移、逆转多药耐药等作用。为进一步探讨瓦草三萜皂甙类化合物的抗肿瘤机制,本研究选取对8/9化合物最为敏感的HeLa细胞为研究对象,观察其对HeLa细胞的生长抑制作用,并从抑制细胞增殖方面进一步探讨瓦草三萜皂甙类化合物诱导细胞周期阻滞在G1期的作用机理。
方法:
一、瓦草三萜皂甙类化合物对肿瘤细胞的生长抑制作用
1.MTT法检测瓦草18种提取物对人大肠癌HT-29细胞系的抗肿瘤活性
2.MTT法检测8/9化合物对不同细胞系的生长抑制作用
3.CCK-8法检测8/9、10/11、12/13三种化合物对HeLa细胞的生长抑制作用
4.CCK-8法检测8/9化合物对HeLa细胞生长抑制作用的时间与剂量关系
二、8/9化合物诱导HeLa细胞凋亡的作用
1.8/9化合物作用HeLa细胞后的形态学观察
2.凝胶电泳检测8/9化合物作用HeLa细胞后的DNA片段改变
3.流式细胞术检测8/9化合物作用HeLa细胞后诱导凋亡的作用
三、8/9化合物诱导HeLa细胞周期阻滞作用及机制
1、流式细胞术检测8/9化合物作用HeLa细胞后细胞周期阻滞作用
2、WesternBlot及RT-PCR方法检测8/9化合物对HeLa细胞G1期关键蛋白cyclinD1在蛋白及mRNA水平上的影响
3、WesternBlot方法及免疫共沉淀方法检测8/9化合物对HeLa细胞G1期相关蛋白水平的影响
实验结果:
一、瓦草三萜皂甙类化合物对肿瘤细胞的生长抑制作用
1.通过MTT法筛查瓦草18种提取物对人大肠癌HT-29细胞系的抗肿瘤活性,结果显示有多种化合物具有抗肿瘤活性,其中8/9、10/11、12/13三种化合物较其他化合物作用明显。
2.为进一步探讨瓦草三萜皂甙类化合物的抗肿瘤作用,我们选取了8/9化合物进行如下实验。通过MTT法筛查8/9化合物对不同肿瘤细胞系的生长抑制作用,结果显示8/9化合物对多种肿瘤细胞系均有生长抑制作用,本研究选取其中对8/9化合物最为敏感的人宫颈癌HeLa细胞作为研究对象。
3.通过CCK-8法检测8/9、10/11、12/13三种化合物对HeLa细胞的生长抑制作用,结果显示8/9、10/11、12/13三种化合物对HeLa细胞均有生长抑制作用,三者活性强弱依次为8/9＞10/11＞12/13。
4.CCK-8法检测8/9化合物对Hela细胞的生长抑制作用有明显的剂量依赖性,且在药物作用12h即产生明显的生长抑制作用。
二、8/9化合物诱导HeLa细胞凋亡的作用
1.不同浓度8/9化合物作用HeLa细胞24h后,相差显微镜下对其形态学进行观察可见:细胞变圆、体积变小、贴壁性减弱;DAPI染色后荧光显微镜下对其形态学进行观察未见核固缩、核碎裂、核溶解等典型的凋亡小体形态。
2.凝胶电泳检测其DNA变化结果显示并未出现凋亡特有的DNALadder条带。
3.AnnexinV-FITC/PI双染后流式细胞术检测结果显示:随着8/9化合物浓度的增加,发生早期凋亡的细胞未见增多。
通过以上不同实验结果表明,8/9化合物抑制HeLa细胞增殖的作用与诱导肿瘤细胞凋亡无关。
三、8/9化合物诱导HeLa细胞周期阻滞作用及机制
1、PI单染后流式细胞术检测结果显示:随着药物浓度的增加,细胞阻滞在G1期。
2、8/9化合物对G1期关键调节因子的影响:结果显示,随着8/9化合物作用浓度的增加,G1期关键调节因子cyclinD1在蛋白水平上表达下降,而在mRNA水平上未见改变。
3、8/9化合物能够影响G1期相关蛋白的表达从而抑制细胞由G1期向S期转化:免疫共沉淀方法检测8/9化合物对HeLa细胞G1期相关因子E2F1蛋白表达量的影响。
结论:
1.明确瓦草中双糖链三萜皂甙类化合物具有广谱抗肿瘤活性。
2.三萜皂甙类化合物可通过上调P16蛋白及下调cyclinD1蛋白表达,使Rb磷酸化水平降低,转录因子E2F1活性缺乏,HeLa细胞阻滞于G1期,从而抑制细胞增殖。