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人工微RNA (artificial microRNA, amiRNA)是在天然miRNA前体序列的基础上,按要求替换其中的miRNA及其互补区域,然后在生物体内按照miRNA的生物合成途径而形成的外源小RNA分子。amiRNA的高效、高特异性以及无离靶效应的优点已经在多种植物中被证实,并被公认为是继hpRNAi技术之后的第二代植物基因功能研究工具。尽管如此,由于amiRNA前体结构的特殊性,人们构建amiRNA表达载体均过程繁琐且费用昂贵。为了解决这一问题,让amiRNA技术在植物研究中应用更加广泛,本研究建立了三种新颖、简单、高效、低成本、高通量的植物amiRNA表达载体构建技术：1.基于一步PCR的无酶克隆和MAGIC的amiRNA表达载体构建技术首先通过本室创建的无酶克隆载体构建技术,构建了三个含有相应amiRNA表达单元的供体质粒pDonor-amiR319aFLC1、pDonor-amiR159aPDS和pDonor-amiR164aE1N2,然后通过接合辅助的遗传整合克隆(mating-assisted genetically integrated cloning, MAGIC)方法将amiRNA表达单元分别转移至植物双元表达载体,获得三个amiRNA表达载体p1301- amiR319aFLC1、p1301-amiR159aPDS和p1301-amiR164aEIN2。将三种amiRNA表达载体分别转入拟南芥,T1代阳性苗均出现了与预期一致的表型；Real-time PCR分析表明,转基因拟南芥中的flc1和ein2基因的表达量明显下降；同位素32P标记示踪也检测到了转基因拟南芥中amiR319aFLC1和amiR164aEIN2的存在。我们利用该方法构建了油菜amiRNA表达载体180多个,成本大大低于现有的amiRNA载体构建技术,测序结果分析表明,该方法获得amiRNA表达单元的一次性成功率在70%以上。2.基于lacO重构的蓝白斑筛选和MAGIC的植物amiRNA表达载体构建技术首先通过重构lacO(共20bp)的方式,将携带7bp lacO序列的amiR319aCHS前体克隆至末端含有13bp lacO序列的载体pD319a-gfp (T);然后通过直观快捷的蓝白斑筛选方式,获得含有供体质粒pD(T)-miR319aCHS的蓝色重组子；接下来通过MAGIC方法将amiR319aCHS表达单元转移至植物双元表达载体,获得amiRNA表达载体p1301 (T)-miR319aCHS。将amiR319aCHS表达载体分别转入拟南芥,T1代阳性种子出现了与预期一致的表型；Real-time PCR分析表明,转基因拟南芥中的chs基因的表达量不同程度地下降。我们采用该方法构建了水稻amiRNA表达载体40多个,对amiRNA表达单元测序分析表明,该方法获得amiRNA表达单元的一次性成功率在90%以上。3.基于多引物直接退火的植物amiRNA表达载体构建方法首先按照预先设计好的miR528PDS, miR528SpⅢ和miR528EuiI的前体序列,设计并合成三组长度为40～50nt的引物(8条/组),每组引物各自退火；经改造获得的表达载体pYH1301-gfp)经HindⅢ&Nco I双酶切、T4 DNA聚合酶外切处理,然后与上述退火产物分别混合,直接转入大肠杆菌,获得amiRNA表达载体pYH1301-miR528PDS, pYH1301-miR528SpⅢ和pYH1301-miR528Euil。我们采用该方法构建了水稻amiRNA表达载体20个,测序结果表明,该方法获得amiRNA表达单元的一次性成功率为100%。这是目前为止所有已知的植物amiRNA表达载体构建方法中,操作最简单、成本最低廉、效率最高的一种。