基于固定化乙酰胆碱酯酶亲和色谱技术的天然活性成分筛选研究

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研究生物活性物质对靶标酶活力的影响是发现高效、低毒、专一性强的新农药的一种有效筛选手段。然而,游离酶因其对反应条件要求苛刻、易失活等缺点不易应用于工业化生产,酶固定化技术则可克服这些缺点。在农药研究领域,酶固定化相关研究主要集中于生物传感器检测环境样品中的农药残留或用以降解相应的农药,鲜见利用该技术进行农药靶标酶抑制剂筛选的报道。乙酰胆碱酯酶(AChE)作为神经传导过程中一种重要的酶类,是很多神经毒剂的作用靶标酶。本论文以天然产物为资源,利用酶-底物-拮抗剂在害虫发生与控制方面的关键作用,以杀虫剂靶标酶-AChE作为识别工具,利用溶胶-凝胶(sol-gel)技术将其固定于复合凝胶载体,制成具有特定酶生物活性的亲和色谱柱,并与HPLC系统联用,建立基于固定化酶亲和色谱技术的高效、快速杀虫活性成分检测和分析体系。运用该体系从植物和内生真菌的次生代谢产物中快速筛选具有酶抑制活性的化合物,并进行定点分离、结构鉴定和活性验证,为其进一步开发成为天然产物农药奠定基础。论文通过sol-gel技术,分别采用sol-gel交联法和sol-gel包埋法制备了两种功能化的复合凝胶酶固定化材料。优化了制备条件(如硅酸酯的用量、制备温度对凝胶的影响等)和固定化条件(交联剂的用量、反应时间、给酶量、pH、温度等对酶固定化的影响),同时测定了凝胶的溶胀率,并利用电子扫描显微镜分析、红外光谱对复合凝胶载体进行了表征。最优条件制备的sol-gel交联法的酶活回收率为71.3±8.1%,Km值为226.16±0.09 mmol L-1;sol-gel包埋法的酶活回收率为82.8±6.0%,Km值为27.24±0.13 mmol L-1.通过酶活回收率、米氏常数和稳定性的对比分析,最终选择sol-gel包埋法制备的AChE固定化酶载体装柱。利用固定化的AChE复合凝胶载体制备成固定化酶亲和色谱柱,用于天然产物中酶抑制剂的筛选。通过比对经过固定化酶亲和色谱柱和空白载体柱的高效液相色谱图,定点分离获得中药厚朴提取物中被酶吸附的特征组分,经鉴定为厚朴酚(1)和和厚朴酚(2),活性测定表明它们对游离AChE的IC50值分别为18.32±2.01 mg L-1和15.19±3.89 mg L-1。酶动力学研究表明1和2对AChE的抑制均属于混合型抑制。而不被固定化酶吸附的化合物如槲皮素-3-O-L-鼠李糖苷(3)和山奈酚-3-O-L-鼠李糖苷(4)对酶则没有抑制作用。通过对褐飞虱(Nilaparvata lugens)的触杀生测实验,测得1和2的LC50值分别为86.32 mgL-1和36.43 mg L-1与传统杀虫剂毒死蜱(81.72 mgL-1)相当。同时,运用分子对接方法对两种化合物的作用机理进行了进一步的探究,发现它们均能与AChE的氨基酸残基发生氢键、疏水等多种类型的相互作用。此外,我们运用此筛选方法还从内生真菌的次生代谢产物中筛选得到一种对AChE具有抑制作用的微生物CDW7,并分离获得化合物flavipin(5),其对游离AChE抑制活性的IC50值为30.934±1.21 mg L-1。
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