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目的:亚洲带绦虫是一种重要的食源性寄生虫,人感染原因是生食含有囊尾蚴的猪肝或野猪等野生动物的内脏。本实验在前期工作的基础上,就以下几方面展开了研究: 1、了解普通调料、饮料对亚洲带绦虫囊尾蚴存活的影响,有助于指导人们改变不良的饮食习惯,以预防亚洲带绦虫病。 2、了解中药雷丸对亚洲带绦虫囊尾蚴体外作用后囊尾蚴的死亡率、一般组织和超微结构形态变化以及细胞凋亡情况,初步探索中药雷丸对亚洲带绦虫囊尾蚴的体外破坏作用。 3、比较中药雷丸与常规驱绦虫药物吡喹酮、阿苯达唑对亚洲带绦虫囊尾蚴体外破坏作用的异同点,有助于进一步认识传统中药雷丸对囊尾蚴病的治疗作用,同时为家畜体内囊尾蚴病的防治提供具有重要指导意义的基础资料。 方法: 1、从贵州省都匀市和独山县采集带绦虫成虫标本,在观察虫体一般形态学的基础上,提取孕节DNA,采用亚洲带绦虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1(Cytochrome c oxidase subunit1,cox1)基因片段的特异性引物对虫体DNA进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,以确定采集的虫体为亚洲带绦虫。 2、从亚洲带绦虫成虫孕节分离虫卵,虫卵经酶法孵育出六钩蚴,将活六钩蚴按5000个/只的感染量经皮下注射免疫抑制的昆明小鼠,感染后58~62 d剖检小鼠,以获取大量成熟囊尾蚴。 3、常温下采用普通的调料及饮料对亚洲带绦虫囊尾蚴进行体外作用,并以生理盐水作为对照组,观测不同作用时间各组囊尾蚴的死亡率,采用确切概率计算法进行统计分析。 4、采用不同浓度的雷丸粉末体外作用于亚洲带绦虫囊尾蚴,以吡喹酮、阿苯达唑作为阳性对照组,并设置生理盐水阴性对照组。作用不同时间后观测各组囊尾蚴的死亡率,采用确切概率计算法进行统计分析;同时对囊尾蚴进行一般形态学、组织学及超微结构观察;并用流式细胞仪检测各组囊尾蚴细胞凋亡率,采用方差分析法进行统计分析。 结果: 1、采集的5条带绦虫呈乳白色,长2.06~2.90 m,节片数为627~873节,节片较薄,头节近方形,有4个吸盘,无顶突和小钩,成节卵巢分2叶,孕节子宫每侧分支数为18~24支。5条虫体提取的DNA经亚洲带绦虫cox1基因片段的特异性引物PCR,均扩增出260 bp的产物。根据一般形态学特征和分子生物学鉴定结果,证实所采集的4条都匀绦虫和1条独山绦虫均为亚洲带绦虫。 2、六钩蚴感染免疫抑制小鼠252只,其中有119只小鼠被感染,感染率为47.22%,共获得囊尾蚴1769个。 3、白酒作用1 min后囊尾蚴死亡率达到41.67%,白酒、30%食盐水作用3 min后囊尾蚴死亡率达到75%、91.67%,食醋、蒜汁、10%食盐水作用5 min后囊尾蚴死亡率达到66.67%、41.67%、75%,10%辣椒水作用15 min后囊尾蚴死亡率达到58.33%,10%辣椒水、姜汁作用25 min后囊尾蚴死亡率达到91.67%、83.33%,红酒作用90 min后囊尾蚴死亡率达到41.67%,以上各组与对照组相比均具有统计学意义(P<0.05);不同调料饮料作用后囊尾蚴死亡率达到100%的时间分别为:食醋5 min、白酒5 min、30%食盐5 min、10%食盐10 min、酱油15 min、姜汁30 min、蒜汁10 min、10%辣椒水30 min、柠檬汁40 min、啤酒90 min、红酒120 min,与对照组相比均具有统计学意义(P<0.05);而鲜橙多、营养快线、可乐作用180 min后囊尾蚴的死亡率25%、8.33%、0%,与对照组相比均没有统计学意义(P>0.05)。 4、(1)药物作用不同时间囊尾蚴死亡率测定:作用6 h、8 h、42 h后,阴性对照组囊尾蚴的死亡率分别为0%、0%、10%,1%雷丸组的死亡率分别为0%、0%、6.67%,5%雷丸组的死亡率分别为0%、3.33%、13.33%,上述雷丸组死亡率与阴性对照组相比均没有统计学意义(P>0.05)。20%雷丸作用6 h、8 h、42 h后囊尾蚴死亡率分别为3.33%、36.67%、70%,与阴性对照组相比,作用6 h后的死亡率没有统计学意义(P>0.05),作用18 h、42 h后的死亡率有统计学意义(P<0.05)。1%阿苯达唑作用6 h、18 h、42 h后囊尾蚴死亡率分别为13.33%、26.67%、50%,与阴性对照组相比,作用6 h后的死亡率没有统计学意义(P>0.05),作用18 h、42 h后的死亡率有统计学意义(P<0.05)。0.04%吡喹酮作用6 h、18 h、42 h后囊尾蚴死亡率分别为23.33%、100%、100%,与阴性对照组相比均有统计学意义(P<0.05)。 (2)药物作用后囊尾蚴的组织病理切片观察发现:各组囊尾蚴先后出现表皮层破坏,并有脱落;皮下层局限性水肿,纤维组织疏松并有断裂,呈泡状。其中吡喹酮组6 h开始出现上述病理学变化,而雷丸组和阿苯达唑组18 h后才开始出现上述病理学变化。随着药物作用时间的延长,破坏程度逐渐加重。 (3)药物作用18 h后囊尾蚴的超微结构观察:扫描电镜观察发现各组囊尾蚴微毛消失,出现溶蚀状孔;吡喹酮组除上述超微结构改变外,囊尾蚴表面还有大量杆状分泌物。透射电镜观察发现各组囊尾蚴皮层和实质区均受破坏,破坏程度吡喹酮最重,雷丸次之,阿苯达唑最轻。但雷丸组囊尾蚴体内的石灰小体消失,吡喹酮组囊尾蚴体内的石灰小体形态结构基本正常。 (4)流式细胞检测仪检测药物作用不同时间囊尾蚴细胞凋亡率:药物作用6 h后,早期细胞凋亡率:吡喹酮组(3.53±0.08%)>20%雷丸组(2.89±0.17%)>阿苯达唑组(2.23±0.09%);作用18 h后,早期细胞凋亡率:吡喹酮组(9.04±0.16%)>20%雷丸组(10.44±0.07%)>阿苯达唑组(3.04±0.23%);作用42 h后,早期细胞凋亡率:20%雷丸组(16.12±0.11%)>吡喹酮组(14.32±0.18%)>阿苯达唑组(9.15±0.11%)。上述各实验组与阴性对照组相比均有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1、根据对采集标本的一般形态学观察和分子生物学鉴定,提示贵州省都匀市和独山县有亚洲带绦虫的分布。 2、常用调料中食醋和30%食盐水对亚洲带绦虫囊尾蚴存活的影响最大,其次是蒜汁、10%食盐水、酱油、姜汁和辣椒水。常用饮料中白酒对囊尾蚴的影响最明显,其次是柠檬汁、啤酒和红酒,但鲜橙多、营养快线、可乐在180 min内仍不能完全杀灭囊尾蚴。该结果对于人们改变日常生活中不良的饮食习惯、避免亚洲带绦虫的感染具有一定指导价值。 3、20%雷丸、1%阿苯达唑、0.04%吡喹酮均导致亚洲带绦虫囊尾蚴明显的组织结构破坏,破坏程度达皮层和实质区,其中吡喹酮最重,雷丸次之,阿苯达唑最轻,药物的起效时间吡喹酮最快,阿苯达唑次之,雷丸最慢。药物作用晚期雷丸还引起明显的囊尾蚴早期细胞凋亡。结果提示雷丸是一种起效慢、破化程度重的杀虫药,对治疗囊尾蚴病有一定的应用价值。