【摘 要】
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叶绿体作为植物光合作用的场所,其将光能转化为化学能为植物的生长发育提供能量来源,研究其发育机理有助于提高作物的光能转化效率,为高产育种提供一定的理论依据。本研究以一个从水稻不育系株1S经EMS诱变的突变体库中分离出的能稳定遗传的黄叶突变体ygl3(yellow green leaf 3)为研究对象,从细胞学角度、分子生物学等角度对其功能进行了深入研究,主要结果如下:1、突变体ygl3苗期表现为黄叶
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叶绿体作为植物光合作用的场所,其将光能转化为化学能为植物的生长发育提供能量来源,研究其发育机理有助于提高作物的光能转化效率,为高产育种提供一定的理论依据。本研究以一个从水稻不育系株1S经EMS诱变的突变体库中分离出的能稳定遗传的黄叶突变体ygl3(yellow green leaf 3)为研究对象,从细胞学角度、分子生物学等角度对其功能进行了深入研究,主要结果如下:1、突变体ygl3苗期表现为黄叶表型,随着自身的发育和温度的升高,其黄叶表型渐渐变为黄绿条纹状,最终叶色与野生型类似。与野生型相比,突变体ygl3叶片中的叶绿素含量显著下降,叶绿素合成速率减慢,叶肉细胞中叶绿体数目减少且发育异常,特别是类囊体片层结构损坏、基粒堆积异常。温度处理表明,突变体ygl3的表型受低温诱导,温度越低,黄叶表型更加明显,叶绿体损伤更加严重。光合指标测定发现,突变体ygl3的净光合速率和蒸腾速率显著弱于野生型。2、遗传分析表明,突变体ygl3的黄叶表型受一对隐性核基因控制。利用突变体ygl3与日本晴杂交构建的F2群体将YGL3基因定位于3号染色体上,标记Inde3和Indel4之间,约122kb的距离内;利用Rice Genome Annotation Project数据库分析发现,定位区间内含有12个开放阅读框(ORF);测序分析发现,ORF10(LOC_Os03g52170)的第二个外显子上发生A-T的突变,导致天冬酰胺变成异亮氨酸;通过遗传互补和基因编辑实验确定了LOC_Os03g52170即为目的基因YGL3。生物信息学分析发现,YGL3编码一个含LYTB结构域的4-羟基-3-甲丁-2-烯基二磷酸还原酶,属于MEP通路。3、实时荧光定量分析表明,YGL3呈组成型表达,在根、茎、叶、叶鞘、穗和不同发育时期的种子中均有表达,但在叶片组织中表达量最高,与GUS染色的结果一致;对不同时期的叶片组织进行定量分析发现,YGL3主要在幼叶中表达;亚细胞定位结果表明,YGL3蛋白定位于叶绿体中,且其N端1-31aa是其叶绿体靶向信号肽;免疫印迹和q RT-PCR分析表明,与野生型相比,突变体ygl3中类囊体膜复合体组分PSI、PSII、Cytb6f和ATP synthase相关基因的蛋白水平和转录水平显著下降,叶绿素合成相关基因的转录水平显著下降。此外,转录分析显示,在突变体ygl3中MEP途径和MVA途径出现了紊乱。4、酶联免疫吸附测定(ELISA)结果表明,YGL3具有4-羟基-3-甲丁-2-烯基二磷酸还原酶活性,且突变后导致酶活性降低;异戊烯基焦磷酸(IPP)含量测定表明,突变体ygl3中IPP含量显著降低。5、酵母单杂交、荧光素酶活性测定和凝胶电泳迁移实验发现,OsPIL11能结合YGL3的启动子并激活其表达。过表达OsPIL11能增加幼苗去黄化过程中叶绿素的合成速率。此外,YGL3编码区具有明显的籼粳分化。
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