由于非特异毒性、缺乏肿瘤选择性以及肿瘤的多药耐药性等,大多数抗肿瘤药物并不像预期那样有效,其对正常组织的毒副作用更是困扰化疗的主要问题。因此,寻求对肿瘤细胞有特异选择性的高效抗癌制剂具有重要的现实意义纳米药物运载系统因具有一定的组织靶向性,在肿瘤靶向治疗方面有着广阔的应用前景。为提高载体靶向能力,除了控制载体粒径在纳米级通过高通透和滞留(enhanced permeability and retention,EPR)效应实现被动靶向外,还可通过物理化学靶向实现纳米药物的肿瘤靶向治疗。由于肿瘤组织细胞外pH值明显低于正常组织,相差约0.5-0.7 pH,可作为癌症治疗的标志物。因此,pH敏感的聚合物胶束和纳米凝胶被用作靶向实体肿瘤细胞外酸性环境的智能响应型药物释放体系的研究成为近年来肿瘤治疗的研究热点。同时,可在微粒表面连接特定抗体或配体实现主动靶向。由于抗原-抗体、受体-配体之间高特异性、高选择性和高亲和性的特点,主动靶向较被动靶向具有更高的靶向效率,因而主动靶向释药系统的研究在国内外也都非常活跃。但迄今为止,有关抗癌药物靶向给药系统的研究,大多以靶向至肿瘤组织为目的,如何使更多的药物到达肿瘤部位后进入肿瘤细胞,真正达到肿瘤细胞靶向给药的目的,是近几年靶向给药系统的研究重点。尽管很多药物运载系统表现出了相当好的肿瘤靶向性,可以将药物递送至肿瘤细胞表面,但由于载体与靶细胞结合后入胞能力较弱,相当大一部分的药物在细胞外释放,药物作用同时也激活肿瘤细胞膜多种基因,多种分子机制协同参与耐药表型的形成,构成耐药性,进一步降低了药物入胞效率,使胞内药物浓度过低,无法有效抑制肿瘤细胞的生长,由此可见,如何克服主动靶向给药体系的缺陷,弥补随之带来的多药耐药性问题是药物转运中的一个关键问题。为实现pH响应性释药、靶向给药、高效入胞相结合的策略,本课题首先筛选智能响应药物载体,研究制备P(CS/NIPAAm)纳米粒,分别包裹三种不同抗肿瘤药物,选取两种不同肿瘤细胞模型,对其理化性能,释药特性,及肿瘤响应性药物释放进行研究。再用FA修饰CS,制备能灵敏响应肿瘤pH值释药的聚合物胶束系统,并同时装载抗肿瘤药物DOX和增敏剂PDTC,研究其理化性能,pH响应释药特性,主动靶向特性及PDTC增敏DOX抗肿瘤药物的程度。为进一步提高载体的载药率,拟用负电荷金纳米粒C5-Au-C11-COOH载药,本阶段主要研究CS和FA-CS转运体系对负电荷金纳米粒的转运能力。实验一在酸敏性聚合物CS的表面修饰以温敏性材料NIPAAm,通过调节配比,使制备的纳米药物载体具有响应肿瘤组织pH值的能力。两亲性聚合物CS-g-NIPAAm自身形成核壳纳米粒,疏水的PNIPAAm为核,亲水的CS为壳。在此项研究中,CAMP、POD和PTX通过物理吸附法被成功包裹入P(CS/NIPAAm)纳米粒的核中。载药率分别为8.4%,2.54%,9.6%;包裹率为73.7%,63.7%,85.7%。空白纳米粒及载药纳米粒形态圆整,粒度均匀,粒径在50-100nm之间。纳米粒密封贮存于4℃冰箱或室温三个月后,纳米粒流动性良好,药物无泄漏,稳定性良好。P (CS/NIPAAm)载药纳米粒在不同pH值时的药物释放呈pH敏感性。溶液pH值小于6.9时,药物累计释放率激增,而当溶液pH值从pH6.9升高至pH7.5时,药物累计释放率下降,呈现出明显的pH依赖释放特性。在温度敏感方面,PNIPAAm载药纳米粒和P(CS/NIPAAm)载药纳米粒的温敏释药点相似,并无明显差别。由于该聚合反应温度高于PNIPAAm的LCST,PNIPAAm在反应过程中变得疏水。随着温度的升高,PNIPAAm的疏水性呈增强趋势。而药物累计释放率随温度升高而增大,就是由于PNIPAAm更加疏水,核收缩,促进药物释放。模拟生理正常组织微环境与肿瘤组织微环境,进行药物累计释放对比。研究结果表明,在正常组织生理条件下,药物累计释放率均为30-40%,而在肿瘤组织微环境时,累计释放率激增至约90%。肿瘤组织低pH值促进CS外壳的溶胀,而肿瘤组织的相对高温促进了PNIPAAm的内核收缩,两者结合导致内含药物累计释放率激增。为更细致的观察纳米粒与细胞的作用,本课题采用荧光素标记纳米粒,使其与肿瘤细胞共培养,用荧光显微镜与荧光强度检测仪分别检测细胞内荧光强度,研究不同pH值培养液中细胞内荧光强度变化,从而研究纳米粒细胞内摄作用。结果表明,pH7.4时,细胞呈现微弱荧光,而在pH6.8时,细胞荧光强度明显增强。上述结果表明,P(CS/NIPAAm)载药纳米粒能灵敏响应肿瘤组织细胞外pH值,进行药物释放,具备了作为靶向抗肿瘤药物载体的潜质。实验二的反应主要通过CS主链上的游离氨基与FA上的羧基形成酰胺键,达到CS化学修饰的目的。1H-NMR和13C-NMR谱图证明了FA成功接合至CS骨架上。FA-CS的取代度为13.79%。利用芘荧光探针在分子水平上对FA-CS溶液的构象行为进行了研究,结果表明环境pH小于7时,发生质子化作用,显示亲水性,在pH5时,CAC约为58μg/mL; pH大于7时,发生去质子化作用,显示疏水性,CAC约为2μg/mL。pH8时,聚合物形成稳定的胶束。随着pH降低,临界胶束浓度(CMC)明显降低,胶束溶液透光率和透射率逐渐增大,稳定性减弱,聚合物发生离子化,亲水性增加,胶束开始解离。测定胶束粒径,表明pH对粒径分布具有影响:pH<7时,纳米粒溶胀加速,大粒径粒子明显增多,粒径为120nm左右。当pH继续降低时,导致聚合物胶束物理稳定性下降,胶束趋于解离,为药物释放提供了条件。本实验采取了调整透析温度、膜孔径、聚合物、药物比例和有机溶剂选择等因素以提高载药率和包裹率。DOX和PDTC的包裹率分别为77.64和86.54wt%,载药率分别为12.34和15.32wt%。本课题研究了37℃时不同pH值(pH5.0-8.0)载药纳米胶束药物释放行为。结果表明,DOX和PDTC的药物释放均呈现pH依赖特性。在中性或碱性pH值时,药物释放缓慢,而在弱酸性pH值时药物释放量2h内达到75-95%。为进一步研究DOX的释放行为及主动靶向机制,本课题采取体外荧光成像实验进行研究。随着DOX的释放,入胞,从内涵体和溶酶体中逃逸,作用于其他细胞器和细胞核,蓝色荧光标记的细胞核逐渐变为紫色。同时包裹PDTC和DOX的纳米胶束给药后,细胞内DOX药物荧光强度明显增高。流式细胞仪检测细胞内药物含量,结果表明单纯DOX给药细胞内药物浓度明显小于FA-CS包裹DOX给药,是FA主动靶向作用及CS能灵敏响应肿瘤细胞外pH值药物释放所导致,而同时包裹PDTC和DOX的纳米胶束,能进一步的提高细胞内药物浓度,表明除主动靶向和pH响应性释药外,PDTC能增敏DOX,克服DOX的多药耐药性。为了进一步提高载药量,实验三研究了用CS和FA-CS纳米凝胶包裹负电荷金纳米粒的理化性质及体外生物学特性。纳米粒用1H-NMR表征结构,动态光散射和透射电镜研究其粒径分布及纳米粒表面形态,结果表明,负电荷金纳米粒能良好包裹与CS或FA-CS纳米粒中,粒径均匀,为100nm左右离子。用western blot筛选FR-α阳性表达细胞株,并以其为阳性对照,A549细胞为阴性对照研究FA的主动靶向作用。给药后,用ICP-MS检测细胞内负电荷纳米金含量,结果表明,负电荷金纳米粒的入胞率约10%左右,而用FA-CS为载体运载之后,入胞率在99%以上,为下一步用金纳米粒接合药物,CS,FA-CS运载纳米金药物的研究打下基础。