牛奶质量安全已成为制约我国奶业健康发展的首要问题。乳蛋白是构成牛奶营养品质的主要物质基础,它既涉及乳品质量安全,又是奶业核心竞争力的标志。目前我国牛奶中乳蛋白的含量普遍偏低(平均为2.8%),不仅达不到奶牛的遗传潜力,甚至低于国家标准(2.95%)。因此,立足我国现实的饲料资源,阐明内源泌乳激素对乳蛋白合成与调控的机理,建立通过内源激素调控改善牛奶品质的理论和方法,已经成为奶业持续健康发展的重要需求。本研究以胰岛素、催乳素和氢化可的松为研究对象,以酶消化法培养得到的奶牛乳腺上皮细胞系为载体分别研究了胰岛素、催乳素和氢化可的松对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的影响。试验一、选择在扬州大学农牧场饲养的健康泌乳期荷斯坦奶牛,活体无菌采取乳腺组织,以酶消化法分离、培养、纯化奶牛乳腺上皮细胞,研究奶牛乳腺上皮细胞的体外培养效果。结果表明：以DMEM/F12为基础培养液,在培养液中添加10%的胎牛血清、300IU/mL的双抗、25ug/mL两性霉素B、表皮生长因子、ITS、氢化可的松、催乳素等组成的完全培养液中奶牛乳腺上皮细胞生长良好。上皮细胞显微结构显示8代以内,大多数奶牛乳腺上皮细胞在体外培养过程中呈卵圆形和多角形,细胞之间连接成片,且细胞界限明显。荧光免疫细胞染色分析结果表明分离培养的乳腺上皮细胞几乎全部呈阳性,四种酪蛋白基因PCR电泳产物结果清晰可见,这证实酶消化法得到的细胞是乳腺上皮来源,且具有正常生理功能,证明本试验成功建立了奶牛乳腺上皮细胞系。试验二、以前期建立的奶牛乳腺上皮细胞系为基础,分别采用单因素5水平试验设计研究了在培养液中添加不同浓度的催乳素(0、5、50、500、5000 ng/mL)、胰岛素(0、5、50、500、5000 ng/mL)和氢化可的松(0、1、10、100、1000 ng/mL)对奶牛乳腺上皮细胞生长、细胞信号通路相关基因表达、乳蛋白合成相关激素受体基因表达和酪蛋白相对含量的影响。结果表明：①催乳素能显著促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖、促进s-PRLR基因表达、促进K-酪蛋白和总酪蛋白的分泌(P<0.05)；在50 ng/mL之前,随着添加量的增加,s-PRLR基因表达量、CSN3基因的表达量,K-酪蛋白和总酪蛋白的相对含量也随之增加,之后随着PRL添加量的增加,其表达量和相对含量反而下降。②5-500 ng/mL的胰岛素能显著促进奶牛乳腺上皮细胞增殖；5～5000 ng/mL的胰岛素均能显著促进奶牛乳腺上皮细胞K-酪蛋白和总酪蛋白的分泌,50 ng/mL的胰岛素还能显著促进CSN3基因的表达;在50 ng/mL之前,随着胰岛素添加量的增加,INSR基因的表达量也随之增加,之后随着胰岛素添加量的增加,其表达量反而下降。③24h之前,氢化可的松对奶牛乳腺上皮细胞的增殖无影响,24h之后1000 ng/mL的氢化可的松显著抑制了奶牛乳腺上皮细胞的增殖；1-100 ng/mL的氢化可的松显著增加了奶牛乳腺上皮细胞CSN3基因表达,1 ng/mL显著增加了NR3C1基因表达,1-10 ng/mL的氢化可的松显著增加了奶牛乳腺上皮细胞中K-酪蛋白和总酪蛋白的相对含量。试验三、以试验二(单因素试验)所得到的胰岛素、催乳素和氢化可的松的最佳作用剂量为基础,以前期冻存的奶牛乳腺上皮细胞为媒介,采用L9(3‘)正交试验设计,研究了三种激素协同作用对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响,对泌乳激素受体基因表达的影响,对乳蛋白合成影响重大的两条信号通路中相关基因表达的影响及对κ-酪蛋白和总酪蛋白相对含量的影响,结果表明：①三种激素协同作用能显著促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖；②5 ng/mL催乳素、50 ng/mL胰岛素和1 ng/mL氢化可的松能显著增加mTOR、Rheb、 PKB、PRAS40、STAT5a和P53基因的表达,三种激素对mTOR信号通路各基因表达的影响程度不一致,对JAK-STAT信号通路各基因表达影响的优先次序为胰岛素>氢化可的松>催乳素,即胰岛素对JAK-STAT信号通路各基因表达的影响最大,其次是氢化可的松,最后是催乳素；③三种激素对s-PRLR基因表达影响的最优组合为催乳素5 ng/mL、胰岛素50 ng/mL和氢化可的松1 ng/mL,对s-PRLR基因的影响程度为氢化可的松>胰岛素>催乳素；对NR3C1基因表达影响的最优组合为催乳素50 ng/mL、胰岛素5 ng/mL和氢化可的松10 ng/mL,对NR3C1基因表达的影响程度为催乳素>胰岛素>氢化可的松；对INSR基因表达影响的最优组合为催乳素50 ng/mL、胰岛素50 ng/mL和氢化可的松0.1 ng/mL,对INSR基因表达的影响程度为催乳素>氢化可的松>胰岛素。④三种激素促进CSN3基因表达、促进κ-酪蛋白和总酪蛋白分泌的最佳浓度组合为A1B2C2,即在奶牛乳腺上皮细胞中添加催乳素5 ng/mL、胰岛素50 ng/mL、氢化可的松1 ng/mL时最有利于CSN3基因表达、K-酪蛋白和总酪蛋白的分泌。试验四、以前期冻存的奶牛乳腺上皮细胞为载体,采用单因素4水平试验设计,即分为对照组、LY294002组、AG-490组和双阻断剂组,通过对相关激素受体基因表达的测定,对两条信号通路中相关正向调节基因表达的测定,对酪蛋白基因和酪蛋白相对含量的测定来对前面得出的结论进行验证。结果表明：在培养液中添加抑制剂极显著的抑制了乳腺上皮细胞的增殖、诱发细胞凋亡；极显著的抑制了mTOR信号通路和JAK-STAT信号通路中正向调节基因的表达；极显著的抑制了奶牛乳腺上皮细胞中K-酪蛋白和总酪蛋白的合成与分泌。因此,本试验得到的总体结论是：胰岛素、氢化可的松和催乳素不论是单独作用还是协同作用均可以促进奶牛乳腺上皮细胞生长和乳蛋白合成。单独作用时胰岛素、催乳素和氢化可的松对奶牛乳腺上皮细胞生长和乳蛋白合成最有效的添加剂量分别是50、50和1ng/mL。胰岛素、催乳素和氢化可的松协同作用对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成影响的最佳组合为胰岛素50 ng/mL、催乳素5 ng/mL和氢化可的松1 ng/mL,三种激素对不同指标影响的优先次序各不相同。泌乳激素对奶牛乳腺乳蛋白合成影响的作用机制是：①转录水平的调节：激素-激素受体-JAK-STAT信号通路调节乳腺发育和乳蛋白的合成；②翻译水平：激素-激素受体-PI3K-AKT-mTOR信号通路调节乳腺发育和乳蛋白合成。这两条信号通路缺一不可。