植物为了适应土壤中不同且变化的营养状况而长期进化产生出灵活和复杂的调控机制。由于土壤环境中矿质营养使用效率直接影响作物的产量和品质,因此对植物矿质元素吸收、转运、分配和利用的稳态分子调控机制需要从多角度深度解析。目前研究主要以转录因子为中心的转录调控为主,而对可变剪接介导的转录后水平调控的功能基因组研究比较欠缺,甚至被低估。可变剪接不仅丰富了蛋白质多样性,而且可以通过转录后调控机制调控基因表达,从而对植物非生物环境胁迫响应、病原体防御、细胞分化命运决定、生长发育、昼夜节律变化调控以及花期转换控制等多种生物过程起着重要作用。本研究希望通过基于转录组测序的水稻矿质元素胁迫下可变剪接比较分析和OsSCL57突变体与野生型的比较研究可变剪接在调控水稻矿质营养稳态中的功能。我们以模式植物水稻为材料,对正常生长14天苗龄的植株根部分别进行对照及缺四种主要微量元素（铁、锌、铜和锰）处理10天,首先通过表型观察、元素含量分析与缺微量元素标记基因的表达分析明确样品的可靠性,然后对各处理条件下的根部样品分别进行polyA富集和rRNA去除建库双端模式短片段转录组测序,两者在基因表达定量和差异分析结果有很好的一致性,但从可变剪接事件定量和差异分析发现rRNA去除相对于polyA富集建库检测更多的内含子未剪接完全转录本,从而使得内含子保留事件比例明显升高,因此针对rRNA去除建库测序数据,我们开发了基于内含子区域测序覆盖深度符合泊淞分布规律的统计检验方法来过滤内含子未剪接完全的组装转录本。此方法原理是假设基因内所有内含子碱基覆盖深度符合泊淞分布,采用平均值估计泊淞分布参数值λ,计算每个内含子平均覆盖深度以及泊淞分布下显著性P-value,根据rRNA去除建库内含子未剪接完全转录本过滤后的转录本与polyA富集组装的转录本比较的特异性和敏感性分析来选择较优的P-value域值。此方法的优势在于考虑到Pre-mRNA内含子序列作为噪音因素影响转录本组装准确性,但并非内嵌于特定转录本组装软件（Cufflinks和CLASS2）的组装过程,近年来发表以StingTie为代表的软件组装敏感度、准确性和计算效率都明显提高,但是对rRNA去除建库测序数据的转录本组装分析结果显示它们未考虑内含子序列噪音问题而更适合于polyA富集建库转录本组装。由于植物可变剪切事件以内含子保留事件（intron retention,IR）为主,我们开发的内含子未剪接完全组装转录本过滤方法有效减少由不完全剪接产物导致的IR。我们对水稻缺磷元素时间点动态处理实验设计与缺微量元素（铁、锌、铜和锰）对照处理实验设计根部样品采用rRNA去除建库RNA-Seq进行不同营养元素胁迫下的可变剪接事件和基因比较分析。采用我们自主开发的可变剪接生物信息学分析流程进行分析,总共得到124,590条组装转录本和对应的50,678个基因。采用rMATS软件预测分析结果显示共53,471个可变剪接事件,12,180个内含子基因发生可变剪接占～37.7%,内含子保留（IR）占主导～67.7%,依次为3端受体可变剪切位点（A3SS）占～16.1%,5端供体可变剪切位点（A5SS）占～10.6%,外显子跳跃（ES）占～5.5%以及外显子跳跃互斥（MXE）占～0.08%。我们对缺不同营养元素分别进行差异表达和差异可变剪接基因分析,两者小于10%的低重叠率说明转录调控和可变剪接调控存在相对独立性,差异可变剪接基因的重叠分析揭示可变剪接存在营养特异性调控,缺磷的总可变剪接基因占表达内含子基因比例随着处理时间梯度显著升高,说明缺磷相对于缺微量元素显著性诱导可变剪接基因。硫转运体基因（Os03g0195800）的IR引入提前终止密码子（PTC）而丢失C端部分氨基酸序列,编码短蛋白的转录本在缺铁条件下显著升高,从而影响在缺铁条件下体内硫元素稳态水平。OsSPX1基因IR中的内含子包含率在缺磷条件下显著上升,从而降低从细胞核到细胞质成熟mRNA的输出效率,OsSPX1基因通过可变剪接调控调节编码蛋白转录本表达水平,与正调控转录因子OsPHR2蛋白相互作用在磷信号调控网络中起负调控作用。为了验证差异可变剪接筛选方法的可靠性,挑选缺磷条件下4个差异可变剪接事件进行RT-PCR验证,结果显示基于转录组测序数据的外显子或内含子包含率在磷胁迫诱导或者抑制趋势与RT-PCR定量基本一致。SR（Serine/Arginine-rich）基因家族通过可变剪接调控机制在植物非生物胁迫响应过程中扮演重要的角色,对高频率可变剪接基因基于已知蛋白结构功能域的功能富集分析结果显示具有RNA结合序列特征（RRM）的RNA结合蛋白基因家族更倾向于发生可变剪接事件。22个水稻SR基因家族成员的转录表达水平并无强烈受到缺营养元素调控,但其中14个SR基因家族成员在缺营养元素条件下发生1个或者以上的显著差异可变剪接事件。通过对OsRS33、OsSCL25、OsRSZ21a和OsSR40差异可变剪接事件影响蛋白翻译分析结果揭示这些可变剪接事件通常与无义介导mRNA降解（NMD）机制联合,或者只编码RNA结合蛋白结构功能域的截短蛋白质而干扰正常完整编码蛋白质行使生物学功能,或者改变3端UTR长度影响mRNA稳定性,从而调控SR基因家族蛋白稳态水平来参与营养胁迫响应过程。前期通过磷含量分析,osscl57是其中一个磷含量发生显著增加的SR基因家族成员突变体,水稻OsSCL57又是植物特异SR蛋白家族中的SCL子家族成员之一。我们对生长12天的水稻osscl57突变体和正常对照根部分别进行polyA富集建库转录组测序,观察到T-DNA插入于OsSCL57基因第8个内含子,从而导致C端不完整的SR结构功能域。两个磷转运体OsPT2和OsPT8在突变体中显著上调。磷信号负调控因子OsSPX4位于第1个内含子发生差异IR,从而导致正常编码蛋白转录本表达上升,正调控因子OsARF16位于第5个内含子IR导致正常编码蛋白质转录本上升。基于差异表达和可变剪接分析结果说明OsSCL57基因通过可变剪接机制调控磷吸收、转运和信号传导网络关键基因的表达水平,从而导致突变体根部磷积累。基于不同矿质营养胁迫下的转录组测序可变剪接比较分析以及osscl57突变体转录组测序分析揭示可变剪接对水稻体内矿质元素稳态起着重要的调控作用,我们开发的基于短片段转录组测序数据的可变剪接生物信息学分析流程对类似其它植物的大规模研究有很大的参考价值,通过osscl57突变体磷相关的差异可变剪接基因分析对磷高效利用作物育种有潜在的应用价值。