【摘 要】
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味觉感受在昆虫的取食、交配和产卵等多项生命活动中起到重要作用,昆虫对味觉物质的感受主要由味觉受体来完成。昆虫味觉受体可分为糖类受体、果糖受体、二氧化碳受体和苦味受体四类,其中,糖类受体和果糖受体参与糖类物质的识别,对昆虫的取食行为具有重要的作用。味觉受体通常存在于昆虫的外周味觉器官当中,如触角、喙、跗节和翅膀边缘等部位,但近年来的研究发现,一些昆虫的味觉受体存在于肠道和脑部等非味觉器官当中,推测这
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味觉感受在昆虫的取食、交配和产卵等多项生命活动中起到重要作用,昆虫对味觉物质的感受主要由味觉受体来完成。昆虫味觉受体可分为糖类受体、果糖受体、二氧化碳受体和苦味受体四类,其中,糖类受体和果糖受体参与糖类物质的识别,对昆虫的取食行为具有重要的作用。味觉受体通常存在于昆虫的外周味觉器官当中,如触角、喙、跗节和翅膀边缘等部位,但近年来的研究发现,一些昆虫的味觉受体存在于肠道和脑部等非味觉器官当中,推测这些味觉受体具有味觉感受之外的功能,对非味觉器官中的味觉受体进行深入研究有助于阐明昆虫取食、交配、产卵等行为机制,理解昆虫对环境的适应性和体内营养调控规律,同时可为开发绿色化工产品进行害虫防治提供理论基础和实验依据。棉铃虫是世界范围内的重要农业害虫,具有寄主广泛、繁殖力强、适应环境能力强和具备远距离迁飞能力等特点,对农业生产造成巨大损失。由于棉铃虫对多种杀虫剂的抗性不断增加,急需开发新型靶标位点对其进行防治。随着棉铃虫全基因组测序的完成,从基因组中鉴定味觉受体基因家族并进行研究成为可能。本研究以棉铃虫为研究对象进行了如下几方面的工作:1)对基于三代测序技术的棉铃虫全基因组进行分析鉴定味觉受体基因家族;2)通过基因克隆获得棉铃虫糖类受体及果糖受体基因序列并进行时空表达分析;3)对棉铃虫果糖受体Harm GR9进行基因编辑并筛选纯合品系;4)对突变体进行取食行为学及生殖行为学测定;5)棉铃虫前肠比较转录组分析探究差异表达基因及功能互作网络;主要研究结果如下:(1)对基于三代测序技术的棉铃虫全基因组进行分析,共鉴定出235个味觉受体基因,系统发育研究表明,鉴定出的基因家族中包含3条推定的二氧化碳受体,8条推定的糖受体,2条推定的果糖受体,其余基因均为推定的苦味受体。将鉴定得到的味觉受体基因在染色体上进行定位,发现棉铃虫味觉受体分布在31条染色体中的16条上,其中,推定的糖受体和果糖受体分别定位在相同的染色体;推定的二氧化碳受体和苦味受体位于不同的染色体,并且苦味受体存在基因家族扩增现象。对味觉受体基因家族进行基因结构分析,结果表明棉铃虫的二氧化碳受体、糖受体和果糖受体均具有较多的内含子结构,与其功能保守性对应。(2)对棉铃虫糖类受体及果糖受体进行基因克隆,成功扩增出棉铃虫的5条糖受体(Harm GR5、Harm GR6、Harm GR7、Harm GR11、Harm GR12)和1条果糖受体(Harm GR9)的c DNA全长序列。对获得全长的受体进行时空表达分析,发现多个味觉受体在外周味觉器官和体内器官中均有表达。其中,糖类受体Harm GR6在幼虫中肠和后肠高表达,Harm GR12在幼虫脂肪体和马氏管中特异性高表达,果糖受体Harm GR9存在于幼虫前肠和成虫腹部等主要的消化器官中,在成虫性腺部位也有较高的表达量。(3)由于果糖受体Harm GR9在棉铃虫不同发育时期的消化器官中具有较高表达量,为探究该基因在棉铃虫取食调控和消化代谢中的作用,采用CRISPR/Cas9系统对棉铃虫Harm GR9进行基因编辑。在G1代中检测到靶标位点处产生多种类型的碱基插入或缺失,突变效率可达75%。通过进一步筛选成功获得-2 bp类型的纯合突变体,该突变类型可以使目的基因产生移码,提前终止蛋白质的翻译过程。突变体和野生型幼虫在虫体长度和体型上无明显差别,但两者在体色上区别明显,突变体多为浅绿色,野生型多为红褐色或黄褐色。对突变体进行幼虫发育历期测试及蛹形态学测试,结果表明突变体从受精卵至化蛹所用时长与野生型相比显著缩短,并且突变体蛹的体积及重量显著高于野生型。(4)对突变体棉铃虫进行多种行为学测试,以探究Harm GR9在不同组织中的功能。取食选择实验中Harm GR9基因的缺失可以使幼虫丧失对多种糖类的偏好性,表明外周器官中的Harm GR9起到取食定向作用。对幼虫和成虫分别进行取食量测试和毛细管饲喂实验,结果发现突变体在不同时期的取食量均显著增加,表明Harm GR9在棉铃虫不同发育阶段的取食调控当中均起到在饱腹条件下抑制取食的作用。棉铃虫生殖行为学测试表明,性腺部位表达的Harm GR9参与雌虫产卵位点选择,但不影响其性腺挥发物成分及相对含量。(5)为探究Harm GR9影响幼虫生长代谢过程的分子机理,对突变体棉铃虫和野生型棉铃虫的前肠组织分别进行转录组测序并进行比较转录组分析,结果表明,Harm GR9的缺失主要影响羧酸代谢过程、有机酸代谢过程和酮酸代谢过程,进一步对多种生物过程产生影响,包括小分子代谢过程、α-氨基酸代谢过程和细胞内氨基酸代谢过程。
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