研究背景随着人口老龄化的加重和人们生活方式的改变,缺血性心脏病的发病率也逐年升高。缺血性心脏病现已成为严重威胁人类生命健康的心血管疾病。对于急性缺血性心脏病的最佳有效治疗是尽快恢复缺血组织的血流,然而临床研究及动物实验发现,随着血流灌注的重建,部分心脏的功能和结构不仅未得到恢复,反而出现更为严重的损伤,这种现象被称为心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。如何做到既尽早恢复缺血组织的血流,又同时减轻甚至解除再灌注引起的损伤,便成为缺血性心脏病治疗中的关键;而明确I/R损伤的发病机制就成为首要的前提条件。现有研究证明:线粒体产生过量的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),被认为是导致心肌I/R损伤的最重要的原因和机制。过量的ROS亦导致线粒体自身的损伤,并会引起线粒体损伤与ROS产生之间的恶性循环。为了维持线粒体的稳态平衡,细胞将通过线粒体自噬机制有选择性地清除损伤的线粒体,以保证线粒体功能得以正常进行。多腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)为一类通过对损伤 DNA 进行多聚ADP-核糖基化来行使DNA修复功能的蛋白酶家族,其中PARP-1所发挥的作用约占整个PARP家族的90%。研究证实,ROS造成的大量DNA链损伤而导致PARP-1的过度激活在心肌I/R损伤中起重要的作用。PARP-1的过度激活将会引起细胞内NAD+和ATP的过度消耗,导致心肌细胞因能量供应不足而凋亡或坏死。PARP-1属于NAD+依赖性的ADP-核糖基聚合酶,其活性依赖于辅因子NAD+的水平;而NADH/NAD+作为线粒体呼吸链上代谢过程的重要底物,其过度消耗将会影响到线粒体氧化呼吸和ATP合成等细胞生物学功能,造成并加重线粒体功能障碍。为维持线粒体功能正常进行及自身稳态,线粒体自噬机制进一步被激活,以消除功能障碍的线粒体,达到对线粒体的质量控制。但已有研究表明,线粒体自噬具有双刃剑作用,适度的线粒体自噬可以促进细胞存活,然而线粒体自噬的过度激活则可导致细胞死亡。因此我们推测:过度活化的PARP-1可以诱发线粒体自噬的过度激活,从而介导着心肌I/R损伤的发生。因此,本课题旨在从PARP调控线粒体自噬现象方面开始,对抑制PARP活性减少线粒体自噬的发生在心肌I/R损伤中所起的心脏保护作用及其机制进行研究。目的1.明确在心肌缺血再灌注中PARP调控线粒体自噬通路的存在;2.确定在心肌缺血再灌注中PARP调控线粒体自噬所起的作用;3.探讨在心肌缺血再灌注中PARP调控线粒体自噬的作用机制。方法1.小鼠心脏缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模型的建立和分组:采用开胸结扎和松开左冠状动脉前降支的方法(缺血时间30 min,再灌注时间2 h)建立小鼠I/R模型。分为假手术组(Sham组),缺血再灌注组(I/R组),缺血再灌注+DPQ(DPQ+I/R组)三组。2.H9C2 细胞及 AC16 细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型的建立和分组:H9C2细胞在乏氧箱中缺氧(1%O2/5%CO2/94%N2)10 h后,在细胞培养箱复氧(5%CO2/95%空气)2 h来构建H9C2细胞H/R模型。分为Control组、H/R组、DPQ+H/R组3组。AC16细胞H/R模型的建立和分组与H9C2细胞相同。3.在H9C2细胞中感染以Parkin为靶点的shRNA慢病毒(Lv-Parkin-RNAi)以降低Parkin蛋白表达水平,蛋白印迹法检测其蛋白敲低的效率。4.在电镜下观察各组小鼠心肌细胞、各组H9C2细胞及感染了Lv-Parkin-RNAi的各组H9C2细胞的线粒体自噬水平。5.细胞免疫荧光法检测各组H9C2细胞线粒体自噬关键通路关键蛋白Parkin与MitoTracker Deep Red FM(线粒体荧光探针)的共定位程度。6.蛋白印迹法检测各组H9C2细胞总蛋白中的COX Ⅳ蛋白、TOM 20蛋白及VDAC蛋白的表达;蛋白印迹法检测各组H9C2细胞、AC16细胞及感染了 Lv-Parkin-RNAi、分别孵育了 CsA和FCCP的各组H9C2细胞的线粒体蛋白中Parkin蛋白的表达。7.DCFH-DA法测定各组H9C2细胞及孵育了 NAC的各组H9C2细胞的ROS水平。8.JC-1染色检测各组H9C2细胞及分别孵育了 NAC、NAD+、CsA、FCCP 的各组 H9C2 细胞的线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,ΔΨm)水平。9.用NAD与ATP试剂盒检测感染Lv-Parkin-RNAi前后的各组H9C2细胞中NAD+与ATP的水平。10.蛋白印迹法分别测定各组小鼠心肌细胞及H9C2细胞、AC16细胞中PAR蛋白的表达及各组H9C2细胞线粒体中PAR蛋白的表达。11.测定TTC染色后的各组小鼠心肌梗死面积。12.各组小鼠的心脏功能的超声测量。13.TUNEL法分别检测各组小鼠心肌细胞、H9C2细胞、AC16细胞及感染Lv-Parkin-RNAi后各组H9C2细胞的凋亡率;流式细胞术检测各组H9C2细胞的凋亡率。14.免疫共沉淀法检测各组H9C2细胞中线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的有效构成蛋白 CypD、TSPO与PAR蛋白的相互作用;免疫共沉淀法检测各组CypD、TSPO蛋白与PARP蛋白的相互作用。结果1.抑制PARP活性减少了心肌缺血再灌注中线粒体自噬的发生(1)抑制PARP活性减少了 I/R诱导的小鼠心肌细胞的线粒体自噬水平①在小鼠心脏I/R中PARP明显激活,应用DPQ后,PARP活性降低。PAR蛋白为PARP的活性产物,其表达量的增加代表着PARP被激活。研究结果表明,sham组小鼠心肌细胞中只有微弱的PAR蛋白表达;I/R组小鼠心肌细胞中的PAR蛋白表达明显增加;应用DPQ后,PAR蛋白表达显著降低,与I/R组相比,具有显著性差异(p<0.05)。②抑制PARP活性减少了 I/R诱导的小鼠心肌细胞的线粒体自噬水平。I/R促进了包裹线粒体(完整或几乎降解)的自噬囊泡的形成及线粒体数量的减少,与sham组相比,具有显著性差异(p<0.05);抑制PARP激活缓解了 I/R诱导的线粒体数目的减少,同时抑制了包裹线粒体的自噬囊泡的形成,具有显著性差异(p<0.05)。(2)抑制PARP活性减少了 H/R诱导的H9C2细胞的线粒体自噬水平;抑制Parkin蛋白表达降低了 H/R诱导的H9C2细胞的线粒体自噬水平①Control组H9C2细胞中只有微弱的PAR蛋白表达;H/R组H9C2细胞中的PAR蛋白表达明显增加;应用DPQ以后,PAR蛋白表达显著降低,与H/R组相比,具有显著性差异(p<0.05)。②在电镜下观察包裹线粒体的自噬囊泡数量,H/R组较Control组明显增多,而DPQ+H/R组较H/R组显著减少,且差异具有统计学意义(p<0.05)。③在激光共聚焦显微镜下观察发现,H/R组Parkin蛋白与MitoTracker Deep Red FM的共定位增加,而应用DPQ后Parkin蛋白与MitoTracker Deep Red FM的共定位则减少,且差异具有统计学意义(p<0.05)。④蛋白印迹法检测结果表明,H/R组线粒体蛋白中的Parkin蛋白较Control组表达增加,而DPQ+H/R组较H/R组则表达减少,且差异具有统计学意义(p<0.05);此外,总蛋白中的COX IV蛋白、TOM 20蛋白及VDAC蛋白的检测结果显示,H/R组较Control组表达减少,而DPQ+H/R组较H/R组则表达增加,且差异具有统计学意义(p<0.05)。⑤Lv-Parkin-RNAi感染的H9C2细胞与Control组相比,其Parkin蛋白表达水平发生显著下调,且差异具有统计学意义(p<0.05)。⑥蛋白印迹法检测各组Parkin蛋白的表达情况,发现H/R组、Lv-NC+H/R组较Control组明显增多,H/R组与Lv-NC+H/R组之间无明显差异,无统计学意义;而Lv-Parkin-RN Ai+H/R组较H/R组及Lv-NC+H/R组显著减少,且差异具有统计学意义(p<0.05)。⑦在电镜下观察各组包裹线粒体的自噬囊泡的数量,发现H/R组、Lv-NC+H/R组的自噬囊泡较Control组明显增多,H/R组与Lv-NC+H/R组之间变化不明显,无统计学意义,而Lv-Parkin-RNAi+H/R组的自噬囊泡较H/R组及Lv-NC+H/R组显著减少,且差异具有统计学意义(p<0.05)。(3)抑制PARP活性减少了 H/R诱导的AC16细胞的线粒体自噬水平①在AC16细胞中,H/R组PAR蛋白的表达较Control组明显增加;应用DPQ以后,PAR蛋白表达显著降低,与H/R组相比,具有显著性差异(p<0.05)。②在AC16细胞线粒体蛋白中,H/R组的Parkin蛋白表达较Control组明显增加,而DPQ+H/R组较H/R组表达显著减少,且差异具有统计学意义(p<0.05)。2.PARP的激活促进了 H9C2细胞H/R中ROS的产生;ROS促进了H9C2细胞H/R中ΔΨm的下降H9C2细胞H/R组的ROS水平较Control组明显升高,NAC+H/R组、DPQ+H/R组的ROS水平较H/R组显著降低,且差异具有统计学意义(p<0.05);H/R 组的ΔΨm 较 Control 组明显降低,NAC+H/R 组的ΔΨm较 H/R组显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.05)。3.抑制PARP活性能够升高H/R处理后H9C2细胞中NAD+和ATP水平;抑制线粒体自噬激活没有改变H9C2细胞H/R后NAD+和ATP水平;外源性NAD+能够逆转H/R诱导H9C2细胞ΔΨm的降低(1)NAD+和ATP水平检测结果表明,H/R组、Lv-NC+H/R组、Lv-Parkin-RNAi+H/R组较Control组表达明显降低,而DPQ+H/R组较H/R组则表达显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.05);而H/R组、Lv-NC+H/R组、Lv-Parkin-RNAi+H/R组三组间表达无差异。(2)H/R显著诱导了ΔΨm的降低,而外源性NAD+则阻止了 H/R诱导的ΔΨm的下降,且差异具有统计学意义(p<0.05)。4.抑制PARP活性具有保护心脏及心肌细胞的作用(1)抑制PARP活性可减少I/R诱导的小鼠心肌梗死面积、降低小鼠心肌细胞凋亡率及改善小鼠的心脏功能DPQ+I/R组与I/R组相比,小鼠心肌梗死面积明显减少(p<0.05)。与sham组相比,I/R显著降低了小鼠的心脏射血分数(p<0.05);与I/R组相比,应用DPQ以后,小鼠的心脏射血分数得到明显改善(p<0.05)。I/R组与sham组相比,心肌细胞凋亡率明显增加(p<0.05);DPQ+I/R组的心肌细胞凋亡率明显少于I/R组的凋亡率(p<0.05)。(2)抑制PARP活性减轻了 H/R诱导的H9C2细胞凋亡采用TUNEL法及流式细胞仪测定各组H9C2细胞的凋亡率:H/R显著增加了细胞凋亡,而应用DPQ后降低了细胞凋亡,且差异具有统计学意义(p<0.05)。(3)抑制PARP活性减轻了 H/R诱导的AC16细胞凋亡TUNEL法测定各组AC16细胞的凋亡率:H/R显著增加细胞凋亡,而DPQ应用后细胞凋亡减少,差异具有统计学意义(p<0.05)。5.线粒体自噬的过度激活促进了 H/R诱导的H9C2细胞凋亡TUNEL法测定各组H9C2细胞的凋亡率:研究结果发现H/R组、Lv-NC+H/R组的细胞凋亡率较Control组明显增高,H/R组与Lv-NC+H/R组之间的细胞凋亡率无明显差异,无统计学意义;而Lv-Parkin-RNAi+H/R组的细胞凋亡率较H/R组及Lv-NC+H/R组显著减少,且差异具有统计学意义(p<0.05)。6.抑制PARP活性通过调节ΔΨm调控H/R诱导的线粒体自噬(1)ΔΨm的检测结果表明,H/R组较Control组显著下降,而CsA+H/R组较H/R组则明显升高,且差异具有统计学意义(p<0.05);DPQ+H/R组较H/R组明显升高,而FCCP+DPQ+H/R组较DPQ+H/R组显著降低,且差异具有统计学意义(p<0.05)。(2)Parkin蛋白的表达结果表明,H/R组较Control组显著升高,而CsA+H/R组较H/R组则明显降低,且差异具有统计学意义(p<0.05);DPQ+H/R组较H/R组明显降低,而FCCP+DPQ+H/R组较DPQ+H/R组显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.05)。7.PARP可能通过对CypD和TSPO的多聚ADP-核糖基化修饰调节ΔΨm(1)线粒体蛋白中PAR蛋白的表达,H/R组较Control组显著升高,而DPQ+H/R组较H/R组则明显降低,且差异具有统计学意义(p<0.05)。(2)CypD和TSPO可以被多聚ADP-核糖基化修饰;而应用DPQ后显著阻止了这种修饰作用。(3)CypD和TSPO蛋白与PARP蛋白无直接相互作用。结论1.在心肌I/R中,PARP的过度激活促进了线粒体自噬的过度发生;2.抑制PARP活性具有保护心脏及心肌细胞的作用;3.线粒体自噬的过度激活参与了 H/R引起的H9C2细胞凋亡;4.PARP通过调控线粒体自噬参与了 H/R引起的H9C2细胞凋亡;5.PARP通过CypD和TSPO的多聚ADP-核糖基化修饰调节ΔΨm而调控线粒体自噬。