膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤。全球,男性膀胱癌的发病率位于第七位,女性膀胱癌的发病率位列第十七。在中国,膀胱癌发病率与死亡率均居泌尿系统肿瘤首位,男女发病比例约为4：1。膀胱癌的病理类型一般为移行上皮细胞癌、鳞状细胞癌及腺癌,其中超过90%为移行细胞癌。膀胱镜检查是诊断膀胱癌的最主要方法。膀胱癌与其他肿瘤显著的不同点在于易复发性,复发的次数与膀胱癌恶性程度及进展息息相关。膀胱癌发生发展是多因素、多阶段的过程,由于其发病机制尚不甚清楚,且复发率很高,无有效的治疗方法,因而难以对膀胱癌实施有效的预防与干预。目前认为吸烟与职业暴露是膀胱癌发病的主要危险因素。另有研究表明,若父母患膀胱癌,其子女罹患膀胱癌的风险将大大增高,提示遗传因素在膀胱癌发生发展中发挥重要作用。越来越多的研究发现,个体遗传因素在膀胱癌发生发展中扮演着重要角色。如,群体中的大多数人都接触相同的环境危险因素,但是只有少部分人最终发生膀胱癌,提示个体遗传易感性存在差异。人类基因组计划也已确认,基因遗传变异将会对基因的表达、结构以及功能产生影响,进而导致机体部分生物学功能的改变。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)是最常见的基因遗传变异。SNPs能够通过改变基因结构或表达量,从而影响基因对机体的调控作用。本课题组前期的研究发现,p53介导的DNA损伤应激反应(MDM2、p53).DNA修复(XRCC1、 APE1、ADPRT)、细胞凋亡(CASP8、FAS、FASL)、免疫炎症(IL4、IL4R,IL13)和叶酸代谢(MTHFR、MTR、MTRR)等多个生物学通路中基因SNPs与膀胱癌的发生发展密切相关。近年来,全基因组关联研究的出现为膀胱癌遗传易感性的研究提供了强有力的工具。Kiemeney和Wu等人在欧美人群中采用全基因组关联研究方法,发现了多个与膀胱癌遗传易感相关的区域或基因,如染色体8q24区域的rs9642880、3q28区域的rs710521和PSCA基因rs2294008等。截至目前,共确认13个与欧美人群膀胱癌易感性相关的SNPs。由此表明,个体遗传易感性在膀胱癌的发生发展中的确起着重要作用。miRNAs (microRNAs,微小RNA)是一类长度为18～23个核苷酸的进化上保守的非编码小RNA分子,可参与包括细胞发育、细胞增殖、分化、凋亡及肿瘤的发生发展。研究发现,单个SNP作用或多个SNPs间的联合作用与肿瘤发生发展及预后显著相关,且可存在明显的环境-基因、基因-基因交互作用。但其确切的机制尚不很清楚。早在2008年,Hu等人就发现miR-196a2上的rs11614913位点可以影响miRNA从pre-miRNA到成熟miRNA的过程,同时发现该位点与肺癌的发生发展密切相关。但是miRNA基因遗传变异在膀胱癌中的研究甚少。近来的研究表明,miRNAs异常表达与膀胱癌的发生发展密切相关：当pri-miRNAs (primary miRNAs,初级miRNAs)存在SNPs,可能会影响pre-miRNAs (precursor miRNAs,前体miRNAs)的生成进而导致成熟miRNAs的表达水平异常；miRNAs生成过程中需要多个关键基因的参与(如DICER、 DROSHA等基因),因此miRNAs生成通路关键基因发生遗传变异时,可能会影响关键基因的表达量或结构功能,最终可致miRNA表达水平的异常。众所周知,miRNAs发挥调控作用是通过与靶基因3’UTR(3’untranslate region,非翻译区)结合引起靶基因mRNA降解或翻译抑制的,从而参与膀胱癌的发生发展。因此,当SNPs位于成熟miRNAs上,可直接影响miRNAs对靶基因的调控作用；类似地,当SNPs位于其靶基因3’UTR与miRNA结合的部位或邻近部位,将影响miRNAs与靶基因3’UTR的结合能力。综上可见,miRNAs相关基因遗传变异与肿瘤发病风险密切相关发生发展中起着非常重要的作用,但是关于膀胱癌的研究报道甚少。本研究拟进一步通过系统探讨miRNAs遗传变异、miRNAs靶基因遗传变异及miRNAs生成通路关键基因遗传变异在膀胱癌发病风险中的作用及其可能生物学机制,为今后膀胱癌的个体化预防、干预与治疗提供理论依据。第一部分miRNAs基因遗传变异与膀胱癌发生发展的关联性及机制研究近年来,miRNAs逐渐为人们所熟悉,被认为在肿瘤的发生发展中起着重要作用。本研究旨在通过分子流行病学病例-对照研究探讨miRNAs基因遗传变异与膀胱癌发病及复发风险之间的关联性,并探讨其可能的生物学机制。首先我们基于miRbase数据库共收集到564个miRNAs,随后结合HapMap、dbSNP及Patrocles数据库筛选符合要求的miRNAs基因SNPs;另外还联合使用Gibbs结合能计算,最终纳入5个位于miRNAs基因上的候选SNPs(miR-146a rs2910164miR-196a2rs11614913、miR-605rs2043556、miR-618rs2682818和miR-923rs47960429)。本研究采用包括1,019例膀胱癌病例与1,182例健康对照的两阶段分子流行病学病例-对照研究方法分析候选SNPs与膀胱癌发病风险之间的关联性,其中一阶段研究包括683例病例和728例对照,二阶段研究中包括336例病例和454例对照)。第一阶段结果显示：在五个候选SNPs中仅发现miR-146a基因rs2910164C和miR-618基因rs2682818A等位基因与膀胱癌发病风险降低呈显著关联(miR-146a基因rs2910164C：调整OR=0.80,95%CI=0.69-0.93,P=0.004；miR-618基因rs2682818A：调整OR=0.81,95%CI=0.69-0.96,P=0.013)。但经Bonferroni校正后,发现miR-618基因rs2682818与膀胱癌发生风险之间的意义消失(P=0.064)。进一步对上述两个位点进行二阶段验证,结果发现：miR-146a基因rs2910164C等位基因仍能降低个体罹患膀胱癌的风险(调整OR=0.80,95%CI=0.66-0.98,P=0.030),但未观察到miR-618基因rs2682818A等位基因与膀胱癌发病之间存在关联性(调整OR=0.84,95%CI=0.67-1.05,P=0.126)。在此基础上,将两阶段样本进行合并再行分析后发现,仅miR-146a基因rs2910164C等位基因可显著降低个体罹患膀胱癌的风险(调整OR=0.80,95%CI=0.71.0.90,P=2.92×104)。进一步分层分析显示,男性携带rs2910164C等位基因较携带G等位基因罹患膀胱癌的风险降低(调整OR=0.76,95%CI=0.66-0.87)；另外,与携带G等位基因者相比,携带C等位基因者无论年龄大小(≤65岁：调整OR=0.82,95%CI=0.69-0.97；>65岁：调整OR=0.78,95%CI=0.66-0.92)、是否吸烟(不吸烟：调整OR=0.80,95%CI=0.69-0.93；吸烟：调整OR=0.80,95%CI=0.67-0.96)、肿瘤分级(低级：调整OR=0.83,95%CI=0.73-0.94:高级：调整OR=0.66,95%CI=0.52-0.85)及肿瘤分期(浅表性：调整OR=0.78,95%CI=0.68-0.89；浸润性：调整OR=0.83,95%CI=0.70-0.99),均可降低膀胱癌的发病风险。我们还针对199例具备完整随访资料的膀胱癌患者分析了miR-146a基因rs2910164与膀胱癌复发风险之间的关系。结果显示,携带rs2910164C等位基因(GC和CC基因型)者较不携带C等位基因(GG基因型)者可显著降低膀胱癌的复发(HR=0.58,95%CI=0.36-0.94,P=0.016)。基于上述关联性研究结果,我们还探讨了miR-146a基因rs2910164的功能学意义。结果表明,miR-146a基因rs2910164可通过调控IRAK1和TRAF6靶基因影响膀胱癌细胞增殖。另外,采用实时定量PCR方法检测64例膀胱癌组织中miR-146a的表达水平,结果显示携带rs2910164CC基因型者的miR-146a表达水平显著高于携带GG与GC基因型的膀胱癌患者约2倍(P=0.010)。以上研究结果提示,miR-146a基因rs2910164遗传变异与膀胱癌发病风险之间存在明显关联,其机制可能与rs2910164变异影响了miR-146a对靶基因IRAK1和TRAF6的增殖调控有关。第二部分miRNAs靶基因EGFR3’UTR遗传变异与膀胱癌发生的关联性及机制研究已知miRNAs靶基因遗传变异与肿瘤的发生发展密切相关。有研究表明,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种酪氨酸激酶跨膜受体,广泛分布于人体各组织细胞膜上,过表达后将启动下游信号通路而参与对细胞凋亡、增殖、分化、侵袭和转移等多个重要生物学过程的调控,与肿瘤(包括膀胱癌)发生发展密切相关。EGFR基因终止密码子下游3’UTR的第774-bp处T>C多态变异(774T>C,rs884225)处在miR-214的结合区域,我们推测该变异可干扰miR-214与EGFR基因mRNA的结合,进而影响EGFR基因的转录后调控参与膀胱癌的发生发展。本研究拟运用病例-对照研究方法,其中包括908例膀胱癌病例和1,239例健康对照,采用TaqMan基因分型方法探讨EGFR基因3’UTR774T>C位点与膀胱癌发病风险之间的关系。结果发现,与携带774TT/TC基因型者相比,携带774CC基因型者罹患膀胱癌的风险明显增加(调整OR=1.29,95%CI=1.05-1.58)。进一步分层分析发现,携带774CC基因型者较携带TT和TC基因型者罹患膀胱癌风险在高龄(>65岁)(调整OR=1.87,95%CI=1.39-2.53)、不吸烟人中更显著(调整OR=1.46,95%CI=1.11-1.92)；在肿瘤分级为中级、肿瘤分期为肌层浸润性膀胱癌患者中,携带CC基因型者较TT和TC基因型者膀胱癌的发病风险明显增加(中级：调整OR=1.34,95%CI=1.01-1.80；浸润性：调整OR=1.40,95%CI=1.05.1.89)。另外,采用双荧光报告基因实验探讨miR-214与EGFR基因3’UTR774T>C位点之间的调控关系。结果显示：将包含774T、774C、774D(D:删除包含该变异位点的18-bp序列)的三种质粒和内参瞬时转染到T24细胞中同时共转染NC(negative control,阴性对照)miRNA或者miR-214。对于转染NC组：C vs.T,P<0.05；Dvs.T,P<0.05。对于转染miR-214的组：Cvs.T,P<0.05；D vs.T,P<0.05。但是,与NC组相比,并未观察到miR-214对靶基因存在特异性的调节作用(P值均>0.05)。该双荧光报告基因实验的结果提示,EGFR基因3’UTR774T>C位点的变化可影响EGFR的表达水平,推测可能是存在其他miRNAs参与调节EGFR的表达而非miR-214或miR-214所起的作用较微弱。以上结果表明,miRNA靶基因EGFR3’UTR774T>C位点可增加膀胱癌的发生风险,且该作用在高龄(>65岁)、不吸烟、肿瘤分级为中级、肿瘤分期为肌层浸润性膀胱癌患者中更显著。第三部分miRNAs生成通路中关键基因遗传变异与膀胱癌发生的关联性及机制研究DICER和1ROSHA基因是miRNAs生成通路中的两个关键基因。DICER和DROSHA蛋白是miRNA生成通路上至关重要的两种RNA酶。本研究旨在探讨miRNA生成通路中关键基因DICER和DROSHA遗传变异与膀胱癌易感性之间的关系及其可能的生物学机制。运用分子流行病学病例-对照研究方法(685例膀胱癌病例和730例健康对照),探讨DICER和DROSHA基因7个功能性的SNPs(即DICER rs12323635C>T、rs13078T>A. rs1057035T>C、rs3742330A>G和DROSHArs2291109A>T、rs10719T>C、s642321C>T)与膀胱癌发病危险性之间的关系。结果显示：ICER rs12323635C>T、 rs13078T>A、rs1057035T>C及rs3742330A>G和DROSHA rs2291109A>T、rs642321C>T与膀胱癌发病风险之间均无显著关联(P值均>0.05),但发现位于DROSHA基因3’UTR的rs10719T>C位点可明显增加膀胱癌的发生风险,其中,与携带rs10719TT基因型者相比,携带rs10719TC和CC基因型者罹患膀胱癌的风险增加了0.25倍(调整OR=1.25,95%CI=1.01-1.55,P=0.041)。进一步分层分析发现,DROSHA基因3’UTRrs10719T>C位点可增加膀胱癌的发病风险,特别是在男性(调整OR=1.34,95%CI=1.05-1.90,P=0.018)和吸烟人群(调整OR=1.56,95%CI=1.14-2.14,P=0.006)中更为显著。随后,采用TargetScan、miRanda、Microcosm PITA四个miRNA预测网站同时预测到miR-27a/b与DROSHA基因3’UTR存在不完全互补配对的区域,提示1DROSHA为miR-27a/b的靶基因。miR-27a/b与DROSHA的3’UTR的靶向结合位点位于rs10719T>C位点上游约46-bp处。基于上述生物信息学分析,本课题运用双荧光报告基因方法探讨rs10719T>C位点是否会影响miR-27a/b与DROSHA3’UTR的结合能力进而影响DROSHA基因转录后翻译。结果显示,T24细胞株中：与转染NC组相比,共转染miR-27a/b mimics与rs10719T质粒会抑制荧光素酶的表达水平(P值分别为0.004和0.001),但是共转染miR-27a/b与rs10719C质粒并未观察到统计学意义(P>0.05)；对应的在J82细胞中：共转染miR-27a/b inhibitor与rs10719T质粒后较NC组,其荧光素酶的表达水平上升了(P值分别为0.012和0.002),但是还发现共转染miR-27a/b inhibitor与rs10719C质粒后,干扰掉miR-27a表达组其荧光素酶表达水平竟下降,另外共转染miR-27b与rsl0719C质粒并未观察到统计学意义(P>0.05)。结果提示,DROSHA基因3’UTR rs10719T>C位点变化可能会影响miR-27b与该基因3’UTR的结合能力。综上可见,DROSHA基因3’UTR rs107f9T>C多态位点可增加膀胱癌的发病风险,而rs10719T>C位点变异可能会影响miR-27b与DROSHA基因3’UTR的结合能力。