论文部分内容阅读
第一部分表面加强激光解吸电离-飞行时间-质谱技术方法的建立和优化目的：建立和优化表面加强激光解吸电离-飞行时间-质谱（SELDI-TOF-MS）技术平台。方法：取华山医院内分泌科住院的2型糖尿病肾病（DN）病人4例、2型糖尿病不伴肾病病人2例、正常人2例的血清和晨尿上清液标本。取病理证实的2型糖尿病肾病病人的肾脏皮质标本及正常肾脏皮质标本各1例，抽提总蛋白，Bradford法定量。采用WCX2、H4、SAX2、IMAC3-Cu2+四种蛋白质芯片，经SELDI-TOF-MS测定蛋白质谱，摸索处理血清、尿液上清和组织蛋白的最佳蛋白质芯片种类和技术参数，评估该技术的稳定性和可靠性。结果：血清蛋白质图谱显示蛋白峰最多的为WCX2芯片；尿液上清蛋白质图谱显示蛋白峰最多的为IMAC3-Cu2+芯片；肾脏皮质组织蛋白质图谱显示蛋白峰最多的为WCX2芯片。WCX2芯片激光强度185，敏感性8；IMAC3-Cu2+芯片激光强度230，敏感性9；SAX2芯片激光强度185，敏感性8；H4芯片激光强度210，敏感性9可获得相对较好的图谱。同一芯片内蛋白质峰强度的变异系数（CV）值为16.72％，质荷比（m／z）的CV值为0.0236％；不同芯片间蛋白质峰强度的CV值为16.76％，m／z的CV值为0.0207％。结论：血清蛋白质组研究宜选用弱阳离子交换表面芯片，研究尿液上清蛋白质组宜选用铜离子螯合表面芯片，肾脏皮质蛋白质组研究宜选用弱阳离子交换表面芯片。蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术重复性高、稳定性好，是比较理想的蛋白质组学研究平台。选择最佳参数及操作过程的标准化对获得可靠的图谱十分重要。第二部分2型糖尿病肾病尿液蛋白质指纹图谱及诊断决策树模型的建立目的：筛选尿液上清中2型糖尿病肾病的生物标记物，建立DN诊断决策树模型，并为探讨DN形成的分子机制提供研究基础。方法：收集72例2型糖尿病肾病患者、33例2型糖尿病不伴肾病患者和29例正常人晨尿上清，采用铜离子螯合表面芯片(IMAC3-Cu2+)，经SELDI-TOF-MS测定得到蛋白质指纹图谱。其中42例DN患者和42例非DN（nonDN）患者组成训练集，通过Biomarker Wizard Software 3.1比较两者间尿液上清蛋白质谱的差异，利用Biomarker Patterns Software 5.0.2建立DN的诊断决策树模型。其余30例DN患者和20例nonDN患者组成测试集，对模型进行盲法验证。结果：IMAC3-Cu2+芯片建立训练集的蛋白质指纹图谱中，DN与nonDN相比较，17个蛋白峰强度相差2倍以上且有统计学意义（P＜0.01），平均m／z为5878.37，11739.37，11967.94，39943.56，66614.06和79433.58的蛋白峰在DN组中上调，而平均m／z为2380.42，3031.64，3899.56，4632.28，4647.32，4760.04，4820.61，4909.51，4966.93，4984.44，5078.44的蛋白峰在DN组中下调。其中4个蛋白建立了DN诊断模型，盲法验证该模型准确率86.00％（43／50），敏感性86.67％（26／30），特异性85.00％（17／20），阳性预测值89.66％（26／29），阴性预测值80.95％（17／21）。结论：DN尿液上清的蛋白质指纹图谱经过Biomarker Patterns Software处理后可以得到DN的诊断决策树模型。模型准确性好，可提供全新的2型糖尿病肾病诊断方法。对差异表达蛋白的进一步研究可能有助于阐明糖尿病肾病的发病机理。第三部分2型糖尿病肾病血清蛋白质指纹图谱及诊断决策树模型的建立目的：筛选血清中2型糖尿病肾病的生物标记物，建立DN诊断决策树模型，并为探讨DN形成的分子机制提供研究基础。方法：收集87例2型糖尿病肾病患者、36例2型糖尿病不伴肾病患者和57例正常人血清，采用弱阳离子芯片CM10，经SELDI-TOF-MS测定得到蛋白质指纹图谱。其中65例DN患者和65例nonDN患者组成训练集，通过Biomarker Wizard Software 3.1比较两者间血清蛋白质谱的差异，利用Biomarker Patterns Software 5.0.2建立DN的诊断决策树模型。其余22例DN患者和28例nonDN患者组成测试集，盲法验证模型的准确性。结果：CM10芯片建立训练集的蛋白质指纹图谱中，DN与nonDN相比较，46个蛋白峰强度相差2倍以上且有统计学意义（P＜0.01）。其中22个蛋白峰在DN组中上调，平均m／z为2505.52，2654.90，3059.07，3253.57，3410.86，3632.77，3668.36，3750.06，4507.37，4558.50，4658.15，4890.31，5078.20，5205.38，5305.65，5318.32，5511.76，5710.27，5761.91，5955.42，5973.47和6779.03；而平均m／z为2049.75，2052.81，2233.97，2235.56，2759.27，2872.63，2936.91，2939.11，3197.31，3266.07，3268.77，3272.09，3402.16，3482.81，3940.55。3961.90，4075.89，4079.94，4096.02，4111.08，4301.82，4969.90，5639.47和6194.51的22个蛋白峰在DN组中下调。其中6个蛋白建立了DN诊断决策树模型，盲法验证该模型准确率90.00％（45／50），敏感性90.91％（20／22），特异性89.29％（25／28），阳性预测值86.96％（20／23），阴性预测值92.59％（25／27）。结论：DN血清蛋白质指纹图谱经过Biomarker Patterns Software处理后可以得到DN的诊断决策树模型。模型准确性好，可提供全新的2型糖尿病肾病诊断方法。对差异表达蛋白的进一步研究可能有助于阐明糖尿病肾病的发病机理。