论文部分内容阅读
肝癌在我国是位列第二位的癌症“杀手”,占我国全部恶性肿瘤死亡人数的18.8%,占全世界肝癌死亡人数的 53%。尽管近几十年以来在肝癌诊治和基础研究方面均取得了长足的进步,但总体而言,肝癌的预后并没有得到显著的改善,5 年生存率仍仅有 5%左右。术后复发转移是阻碍生存率进一步提高的最大的障碍。即使是根治性切除,术后 5 年内,仍有 60%~70%的患者出现转移复发,而淋巴道转移也是肝癌最常见的转移表型之一。针对肝癌术后转移复发的研究是21 世纪肝癌研究重点。 肝癌的动物模型和细胞模型是肿瘤转移研究的重要基础和平台,现已建成了许多稳定的应用广泛的肝癌动物模型和细胞系,但绝大多数动物模型不发生转移,其中有明确的淋巴道转移潜能的人肝癌动物或细胞模型尚未见报道。肿瘤的转移是一个高度有序的、非随机的、器官特异性的过程,宿主微环境积极地参与了肿瘤细胞转移的全过程。目前,器官特异性转移的研究是肿瘤研究的热点之一,但其具体机制仍然不清楚。近来研究表明,趋化因子及其受体在肿瘤细胞迁移、侵袭和转移过程中有着重要的作用,发现了一些与特定肿瘤的器官特异性转移相关的趋化因子及其受体,为转移的防治提供了新的靶点和策略。但趋化因子及其受体在肝癌转移中的研究尚未见报道。 本课题应用连续体内筛选的方法,建立高淋巴道转移潜能的人肝癌细胞系HCCLYM,进而通过有限稀释法进行单克隆化,筛选高、低淋巴道转移潜能的单克隆细胞株 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L,并对其转移特性和基本生物学性状进行鉴定。具有人肝癌淋巴道转移模型体系的建立,为肝癌的淋巴道转移研究建立适宜的研究平台,也进一步丰富和完善本所的肝癌转移模型系统。应用分类基因芯片研究趋化因子及其受体在肝癌器官特异性淋巴道转移中的作用,寻找与肝癌的淋巴道器官特异性转移相关的趋化因子及其受体,并对其作用机制作初步的探讨。 第 一 部 分 人肝癌淋巴道转移模型体系的建立及鉴定 本部分的研究目的是建立具有高淋巴道转移潜能的人肝癌细胞系,克隆分离 1<WP=5>博士论文 中文摘要具有不同淋巴道转移潜能的肝癌细胞株,并对其转移特性和基本生物学性状进行鉴定,为肝癌的淋巴道转移研究建立适宜的研究平台。 应用本所建立的具有多向高转移潜能的人肝癌细胞系 HCCLM6 为细胞母系,接种于裸鼠的爪垫部位,原代培养扩增转移淋巴结中的肝癌细胞,重新接种于裸鼠爪垫,连续 8 轮上述筛选,逐步扩增和纯化细胞母系中具有较高的特异性的淋巴道转移潜能的肿瘤细胞,建成具有高淋巴道转移潜能的人肝癌细胞系HCCLYM。 HCCLYM 细胞系肝脏原位移植淋巴结转移率为 83%,肺脏转移率为 40%;体外培养时为典型的多边形上皮样细胞,贴壁生长,接触性生长抑制丧失,细胞平均直径 38±2 微米,群体倍增时间 31.6 小时,克隆形成率 54±4%,亚三倍体核型,染色体数目范围 45~68 条,主流染色体数目为 56~60,占 78%,比较常见的标志性染色体有 i(X)(q10),der(4)t(4;?)(q31;?),Y 染色体缺如,并可见有同源染色区的标志性染色体;流式细胞检测细胞周期各时相的百分率分别为G0-G1 期 54.25%,S 期 25.56%,G2-M 期 10.45%,G2/G1 为 2.04;明胶酶谱法检测表明 HCCLYM 细胞可分泌大量 MMPs,其中以 MMP-2、MMP-9 及其活性型为主;PCR 法检测细胞基因组中有 HBV DNA 整合。 HCCLYM 细胞系采用有限稀释法单克隆化,得到 32 个单克隆细胞株,经过2 轮裸鼠体内筛选,挑选淋巴道转移潜能差别最大的两个单克隆,建株,命名为高、低淋巴道转移潜能人肝癌细胞株 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L。 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 单克隆细胞株肝脏原位移植淋巴结转移率分别为 100%和 30%,而肺转移率均为 30%。HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 细胞平均直径分别为 37±4 微米和 38±5 微米;群体倍增时间分别为 30.3 小时和 32.3 小时;克隆形成率分别为 37±6%和 27±7%。流式细胞分析 HCCLYM-H 细胞株细胞周期各时相的百分率分别为 G0-G1 期 56.95%,S 期 29.93%,G2-M 期13.12%,G2/G1 为 2.04。而 HCCLYM-L 细胞株细胞周期各时相的百分率分别为 G0-G1 期 60.48%,S 期 27.03%,G2-M 期 12.49%,G2/G1 为 2.04。核型分析结果显示 HCCLYM-H 细胞株染色体数目范围 53~60 条,主流染色体数目为55~57,占 87%;而 HCCLYM-L 细胞株染色体数目范围 50~58 条,主流染色体数目为 53~56,占 83%;HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 细胞株均可见标志性染色体 i(X)(q10),der(4)t(4;?)(q31;?),Y 染色体均缺如,但仅 HCCLYM-H 细胞株中可见同源染色区。图 1.10 为 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 细胞株的代表核型。。两株细胞在体外培养时均可分泌基质金属蛋白酶,以MMP-2 、MMP-9及MMP-9的活性型为主,其中 HCCLYM-H 分泌 MMPs 的能力明显强于 HCCLYM-L。两克隆细胞株均可同基底膜组分 IV 型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白发生粘附, 2<WP=6>博士论文 中文摘要其中同 FN 的粘附能力最强,而 HCC