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第一部分:神经干细胞的体外培养、诱导分化及胱胺干预实验研究目的:探讨新生小鼠海马来源神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)的体外分离、培养、诱导分化及鉴定的方法,为进一步胱胺药物体外干预实验提供细胞来源。观察胱胺对神经干细胞增殖分化及对神经细胞分泌表达脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)的影响。材料和方法:从新生C57BL/6J小鼠大脑分离海马组织,采用机械吹打获取单细胞悬液,通过悬浮培养并利用细胞生长因子诱导获得NSCs,从细胞形态、细胞免疫荧光染色分析细胞表面标志物Nestin鉴定NSCs。将培养至第四代的NSCs进行贴壁培养诱导其向神经细胞分化,从细胞形态、免疫荧光染色分析神经元细胞表面标志物βⅢ-tubulin、胶质细胞表面标志物GFAP鉴定诱导分化的细胞。对神经干细胞行贴壁培养,在培养液中加入胱胺,通过细胞计数及免疫荧光染色观察胱胺对神经干细胞增殖分化的影响。通过ELISA和WB分别检测细胞培养上清液及神经细胞中BDNF的分泌表达。结果:小鼠海马来源的NSCs在无血清神经干细胞培养基中悬浮培养24h后可见3-5个NSCs形成细胞团,呈亮球状。培养5d后,细胞球急剧增殖,聚集成典型神经球。细胞传代后其生长形态与原代细胞相似,3-5天可形成典型神经球。培养至第4代的神经干细胞球行细胞免疫荧光染色,显示NSCs特异性标志物巢蛋白(Nestin)。将NSCs诱导分化后细胞免疫荧光染色显示βⅢ-tubulin、GFAP阳性率分别为5.2%、93.5%。胱胺促进神经干细胞的增殖及向神经元细胞分化,增加诱导分化的神经细胞BDNF的分泌表达水平。结论:成功从新生小鼠海马组织分离培养出NSCs,通过鉴定,该细胞具有神经干细胞的标志特性,具有多功能分化潜能,能够诱导分化为神经元、星形胶质细胞等主要神经细胞。胱胺增加神经细胞BDNF的分泌表达水平,促进神经干细胞增殖及向神经元细胞的分化。第二部分:建立光化学栓塞法小鼠局灶性缺血性脑卒中模型目的:光化学栓塞法建立小鼠局灶性缺血性脑卒中模型,应用小动物专用7.0T高场强磁共振评价该模型的稳定性及可控性。并对小鼠神经运动功能缺失进行评测,为下一步胱胺治疗缺血性脑卒中提供可靠的动物模型。材料与方法:雄性C57BL/6J小鼠20只,随机分为两组:模型组和假手术组,每组n=10只。将玫瑰红1OOmg/kg通过腹腔注射进入体内,运用4mm直径冷光源光束透过颅骨照射运动功能区大脑皮层15min。假手术组操作方法与模型组相同,仅腹腔给予不含玫瑰红的生理盐水注射。在模型建立后24小时及7天,应用7.0T micro-MR行头颅T2WI扫描。在模型建立后第7天通过走网格和圆筒站立测试评价小鼠神经运动功能的缺失。建模24小时磁共振扫面结束后每组随机处死4只小鼠,取脑组织行TTC染色。模型建立7天后处死剩余小鼠,脑组织行尼氏染色,通过磁共振图像和病理染色图像对比分析评价该模型梗死灶部位及体积大小的稳定性。结果:脑卒中模型建立24小时后无操作相关动物死亡,磁共振成像显示在小鼠大脑皮层运动功能区形成稳定的梗死灶,TTC染色进一步证实梗死灶的形成。梗死灶体积相对健侧大脑半球体积百分比在T2WI图像、TTC染色切片分别为17.1±3.7%、15.6±2.3%,两者没有统计学差异。模型建立第7天的T2WI图像及尼氏染色病理切片分析结果显示该模型可在大脑运动皮层形成部位、大小稳定可靠的梗死灶。神经运动功能测试证实模型鼠梗死灶对侧肢体有明显运动功能缺失。假手术组未出现异常MR信号、TTC染色呈阴性,运动功能正常。结论:成功建立了光化学栓塞法小鼠局灶性缺血性脑卒中模型,该模型操作简单、创伤小,缺血梗死灶部位及大小稳定可控。可用于药物在治疗缺血性脑卒中神经保护及神经运动功能恢复中的疗效评价,为下一步胱胺治疗缺血性脑卒中提供可靠的动物模型。第三部分:胱胺治疗小鼠局灶性缺血性脑卒中模型的实验研究目的:探讨胱胺治疗小鼠局灶性缺血性脑卒中模型在神经功能恢复中的作用,通过磁共振 T2 加权成像(T2 weighted Imaging,T2WI)和弥散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI),结合组织病理学方法研究胱胺在治疗小鼠缺血性脑卒中模型中的可能机制。材料与方法:采用光化学栓塞法建立小鼠局灶性缺血性脑卒中模型。脑卒中模型建立24小时后开始给予胱胺或生理盐水治疗,通过腹腔注射连续给药7天或42天(每天1次、100mg/kg)。分别在建模前及建模后第7、14、28及42天进行神经功能评测。在脑卒中模型建立24小时后及第7天进行磁共振T2WI扫描评估小鼠大脑梗死灶体积大小。在建模后第42天进行磁共振DTI成像,评估神经纤维轴突结构的重塑。运用ELISA及免疫组化染色检测胱胺对脑组织脑源性神经因营养因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)分泌表达的影响。结果:胱胺治疗可以显著改善小鼠局灶性缺血性脑卒中的预后,促进缺失神经运动功能的恢复。胱胺治疗7天后显著提高脑组织中BDNF的表达水平及其受体TrkB的磷酸化(P≤0.05)、促进室下区及海马区的神经祖细胞的增殖(P≤0.05),减少梗死灶周围神经元的凋亡。胱胺治疗第42天DTI成像及髓鞘碱性蛋白免疫组化染色结果显示脑白质纤维数量增加(P≤0.05)。结论:胱胺在治疗脑卒中后神经纤维轴突重构、神经再生和神经保护中发挥积极作用,进而促进小鼠局灶性缺血性脑卒中模型的神经功能恢复。而在这一过程中,胱胺通过提高脑组织BDNF的表达分泌水平,进一步激活BDNF/TrkB通路发挥重要作用。这为临床治疗缺血性脑卒中提供新的治疗策略和药物治疗靶点。