骨骼系统是机体内一个重要的代谢器官,既往的研究普遍认为,骨骼系统的代谢方式主要是通过全身的激素调节或局部的调控因子通过对成骨及破骨细胞等骨骼系统相关的细胞进行调控,从而影响骨骼系统的代谢平衡。随着对机体骨代谢认识的不断深入,近期的研究结果表明,神经系统和骨骼系统的代谢之间可能存在重要的联系。2013年,日本科学家通过敲除小鼠神经系统中的轴突生长诱导因子Semaphorin3A后,发现小鼠股骨及椎体骨量随着神经系统中感觉神经的大量丢失而明显减少,但与此同时,交感神经数量并未发现显著异常。由此,他们首次提出了感觉神经调控骨代谢这一概念。与之相符合的是,临床上有一类患有先天性无痛无汗症的患者,造成这一现象的主要原因是由于患者先天因TrkA编码基因的突变造成其功能丧失,导致神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）不能发挥其促进和维持神经纤维的生长的作用。这类患者有明显的骨骼系统异常表现。因此,基于感觉神经参与调控骨代谢的现有证据,我们意识到进一步探索感觉神经调控骨代谢机制的必要性。前列腺素E2是骨代谢过程中一个重要的因子。大量的研究表明前列腺素E2有显著的促进骨生长,加快骨折愈合以及治疗骨质疏松的作用。但是,在前列腺素E2治疗骨质疏松的过程中发现其存在大量的副反应,并且,这些副作用多数与神经系统相关。同时,前列腺素E2在炎性疼痛中发挥重要的作用,可致敏感觉神经,增强炎性疼痛。在临床中应用非甾体类抗炎药物治疗炎性疼痛时,长期服用的患者易出现骨量降低或骨质疏松的情况。相反,先天性HPGD基因突变患者体内出现增高的前列腺素E2水平,患者均有尺桡骨、胫腓骨骨膜下新生骨形成的表现。通过以上分析,我们推测前列腺素E2可能通过感觉神经发挥其骨代谢的调控作用。因此,本课题通过一些列验证实验证明了感觉神经通过前列腺素E2发挥骨代谢调控的作用。第一部分感觉神经参与维持骨代谢平衡【目的】探索感觉神经在骨代谢平衡调控过程中是否发挥作用,明确感觉神经缺失时骨代谢过程所发生的变化。【方法】在本章节的研究过程中,我们利用条件基因敲除小鼠Avil-TrkA^F592A,阻碍感觉神经的生长,并通过Avil-iDTR^fl/-小鼠体内注射白喉毒素诱导的方法,在成年小鼠中诱导感觉神经的凋亡,从而以两种不同的感觉神经损伤模型为基础,分别模拟生长发育时期和骨重建时期感觉神经缺失的体内环境。通过micro-CT扫描分析、Masson硬组织染色、CGRP及OSX免疫荧光染色,Osteocalcin免疫组化染色以及Trap化学染色的方法,确定神经敲除模型小鼠体内骨代谢的变化情况。【结果】在基因敲除小鼠Avil-TrkA^F592A中,3月龄雄性小鼠股骨骨量BV/TV约为11.02%,较野生型小鼠减少了7.49%,同时伴有成骨细胞数量的显著减少。在Avil-iDTR^fl/-小鼠体内注射白喉毒素诱导模型中,在2月龄开始诱导感觉神经的凋亡,通过micro-CT检测发现,感觉神经诱导凋亡后,小鼠股骨骨量降低了3.77%,Masson硬组织染色也进一步证明小鼠股骨随着感觉神经的凋亡而显著减少。通过CGRP和OSX共定位染色,我们观察到感觉神经和成骨细胞之间存在毗邻的位置关系。并且【结论】通过条件敲基因小鼠损伤体内感觉神经,明确了感觉神经功能异常或感觉神经缺失的情况下,小鼠股骨骨量显著减少,并伴有成骨及破骨细胞数量的异常。由此可见,非可诱导和可诱导神经凋亡的基因小鼠分析结果表明感觉神经在生长发育阶段和骨重建阶段均参与骨代谢的调控。同时,荧光染色明确了感觉神经和成骨细胞的位置关系,提示两者间可能存在可能的相互作用关系。第二部分前列腺素E2通过感觉神经维持骨代谢平衡【目的】探索前列腺素E2是否通过感觉神经对骨代谢起调控作用,从而提出感觉神经调控骨代谢的可能机制。【方法】本章节我们通过ELISA检测不同骨质疏松小鼠血清和骨髓中前列腺素E2的浓度,确定其在不同骨质疏松情况下的体内表达水平。另外,通过股骨micro-CT和组织形态学检测在成骨细胞中敲除前列腺素E2上游合成酶COX2获得的小鼠(OC-COX2^-/-)骨表型,明确前列腺素E2是否参与骨代谢的调控并进一步探索参与骨代谢调控的前列腺素E2的主要来源。同时,通过micro-CT,组织形态学染色以及钙黄绿素动态骨形成等观察在感觉神经中敲除前列腺素E2受体EP4所获得的小鼠(Avil-EP4^-/-)骨表型,探究前列腺素E2调节骨代谢的作用方式是否是通过感觉神经完成的。【结果】不同小鼠骨质疏松模型的血清前列腺素E2水平检测结果显示在三种骨质疏松模型中,包括卵巢去势小鼠、交感兴奋小鼠和老年小鼠中,前列腺素E2的血清表达量均显著高于其对照组。同时,在卵巢去势小鼠的骨髓腔中,前列腺素E2的释放量也较假手术组显著增高。通过敲除成骨细胞中COX2限速酶,并通过micro-CT检测,我们发现OC-COX2^-/-小鼠股骨骨量较野生型对照组降低,其BV/TV值为10.95%,较对照组降低3.88%。组织形态学染色发现成骨细胞数量减少是这一基因鼠模型导致骨量减少的主要原因。在感觉神经敲除前列腺素E2受体EP4小鼠中(Avil-EP4^-/-),股骨micro-CT分析发现,该小鼠模型骨量也明显减少（野生组16.23%,EP4敲除组9.584%）。组织学染色提示,成骨细胞减少及破骨细胞增多是导致这一基因型小鼠骨量减少的原因。进一步通过动态骨形成实验结果显示,在野生型小鼠中前列腺素E2能够促进小鼠新生骨形成,而在感觉神经敲除EP4小鼠中,这一现象被显著抑制。【结论】骨质疏松模型中小鼠体内前列腺素E2水平增高提示该因子在骨代谢活跃时代偿性增加。而通过对OC-COX2^-/-和Avil-EP4^-/-小鼠模型的研究证明,骨骼系统来源的前列腺素E2能够通过感觉神经发挥正性骨代谢调节的作用。第三部分感觉神经维持骨代谢平衡的调控机制【目的】探索感觉神经参与骨代谢的调控机制。【方法】以钙离子成像的方法,通过体内外给予前列腺素E2处理并给予感觉神经元钙离子刺激,在显微镜下连续动态观察感觉神经元动态激活变化情况。给予野生型和Avil-EP4^-/-小鼠体内前列腺素E2刺激,观察其下丘脑五羟色胺信号通路的变化。通过免疫荧光染色研究骨骼系统中交感神经在感觉神经敲除EP4受体时的变化。另外,给予野生型和Avil-EP4^-/-小鼠体内注射β2肾上腺素受体阻断剂普萘洛尔,观察该基因型小鼠的骨表型变化。【结果】我们发现前列腺素E2可以致敏感觉神经元,能够显著增强感觉神经元激活,但这一作用在感觉神经敲除EP4小鼠上显著减弱。在野生型小鼠外周注射前列腺素E2后,通过蛋白免疫印迹实验可以观察到下丘脑五羟色胺信号通路的逐步激活。然而,在感觉神经敲除EP4受体后,这一活化作用显著受到抑制。进一步股骨切片染色发现,在交感神经分布的部位,Avil-EP4^-/-小鼠股骨中有更多的去甲肾上腺素递质释放。β2肾上腺素受体阻断剂普萘洛尔可以部分挽救Avil-EP4^-/-小鼠的骨丢失现象。【结论】本章节的实验结果提示外周的前列腺素E2可以通过刺激感觉神经的兴奋,将外周的信号传递到中枢神经系统,并通过下丘脑五羟色胺信号通路及交感神经系统的外周调控作用完成骨代谢的反馈调控通路。