论文部分内容阅读
在植物抗病基因工程育种中,利用CaMV35S等组成型启动子调控抗性基因(如抗菌肽、病程相关蛋白、R-gene)的表达是一种常见的表达策略。但功能基因组成型表达往往会产生大量异源蛋白质或导致代谢产物在植物体内积累,打破植物原本的代谢平衡,不利于产量和品质的提高;有些代谢产物对植物并非必需甚至有毒害作用,阻碍了植物的正常生长,甚至导致死亡。选用合适的病原诱导启动子控制抗病相关基因的表达,能够定时的启动抗性基因的表达;避免外源基因在植物体内的过量表达,进而降低甚至消除对植株生长发育的负面影响。在柑橘溃疡病抗病基因工程研究中,很少有关于利用病原物诱导启动子控制抗性基因提高柑橘抗性的研究报道,更没有关于柑橘来源的病原物诱导启动子的研究文献。因此,如何利用其它物种来源的病原物诱导启动子调控抗病基因,提高柑橘对溃疡病的抗性值得研究。本文分析了来源于烟草和马铃薯的病原物诱导启动子在柑橘中的表达特征,主要结果如下:1,病原诱导启动子的克隆pppl和hrs203j是来源于烟草的病原诱导启动子,能响应多种病原菌;gst1是来源于马铃薯的病原诱导启动子,对病原菌具有广谱的响应。根据ppp1、gst1、hrs203j启动子的碱基序列,设计引物。PCR扩增相应的启动子,通过T-克隆测序验证,获得了正确的启动子序列。2,病原诱导启动子与gus报告基因融合的植物表达载体的构建用HindⅢ和BamHI将测序正确的启动子从T-载体上酶切下来,连接到同样用HindⅢ和BamHI处理的pBI121载体上,构建与gus报告基因融合的植物表达载体:PBI121-ppp1、PBI121-gstl、PBI121-hrs203j;3,三个启动子的伤诱导表达特征分析1)GUS组织化学染色结果表明,伤诱导处理前,在ppp1和hrs203j转基因柑橘中,未检测到gus基因表达,而在gst1转基因柑橘中,检测到gus基因的本底表达;pppl启动子转基因柑橘叶圆片在伤诱导处理24h时染色最深,gst1启动子转基因柑橘叶圆片在伤诱导处理12h时染色最深,hrs203j几乎在柑橘中不具有表达功能。2) Real-time PCR和GUS酶活分析表明,ppp1在伤诱导处理之前激活gus基因表达量很低,伤诱导处理24h,gus基因表达量和GUS酶活显著提高;gst1在伤诱导处理前存在背景活性,伤诱导处理12h,gus基因表达量和GUS酶活明显提高。4,三个启动子溃疡病细菌诱导分析1)GUS组织化学染色结果表明,在未接种病原物时,在ppp1和hrs203j转基因柑橘中,未检测到GUS表达,而在gst1转基因柑橘中,检测到gus基因的本底表达;处理5d时,在ppp1转基因叶片中出现蓝色斑点;10d后,叶片出现病斑,此时蓝色斑点主要集中病斑处,且ppp1和gst1都达到最高表达水平。2) Real-time PCR和GUS酶活定量分析表明,溃疡病处理之前(Od), pppl激活gus基因的表达水平极低,在发病时(10d),gus基因的表达水平显著提高;gstl在溃疡病处理之前有背景活性,在发病时激活估算基因的表达水平明显提高。