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近年来,由动脉粥样硬化引起的心、脑血管事件发生率越来越高。这些病例中相当一部分的病理基础是斑块内出血。斑块内出血与斑块内微血管新生有密不可分的联系。类胰蛋白酶(tryptase)是一种具有多种生物学活性的天然蛋白酶,与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。我室前期研究证明：类胰蛋白酶能够招募中性粒细胞,启动炎症反应；能够刺激内皮细胞合成IL-1p和IL-8,并促进IL-8的释放；通过激活单核细胞膜上的PAR-2,大量分泌IL-6、TNF-a和IL-1β,从而影响动脉粥样硬化的血管炎性病变过程。而最近研究表明,在真皮组织中,抑制类胰蛋白酶活性可显著降低肥大细胞刺激内皮细胞使其形成毛细血管管腔样结构的能力,并明确提出,类胰蛋白酶是一种新发现的、强有力的血管新生诱导因子。但类胰蛋白酶是否促进动脉粥样硬化斑块内出血目前还不清楚。本课题拟构建过或干扰表达类胰蛋白酶的慢病毒载体,从体内和体外两方面探讨类胰蛋白酶与斑块内出血的关系。本研究主要分三部分,第一部分构建类胰蛋白酶表达或干扰慢病毒载体我们采用全基因酶切位点设计、合成获得小鼠类胰蛋白酶基因,在此基础上成功构建了过表达和干扰tryptase慢病毒载体,为下一步进行体内体实验奠定基础.第二部分类胰蛋白酶对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块内出血的影响及机制我们首先对ApoE-/-小鼠行颈总动脉套环术,建立动脉粥样硬化斑块内出血模型。然后,对小鼠尾静脉注射过或干扰表达类胰蛋白酶的慢病毒载体,观察斑块状况。实验分为肥大细胞脱颗粒组、肥大细胞稳定剂组、LV-GFP-Tryptase脱颗粒组、LV-GFP脱颗粒组、LV-RFP-siRNA稳定剂组和LV-RFP-controlsiRNA稳定剂组。HE染色结果显示,未套环侧LV-GFP-Tryptase脱颗粒组颈总动脉斑块面积显著大于其他组,而LV-RFP-siRNA稳定剂组斑块面积最小。肥大细胞脱颗粒组斑块面积小于LV-GFP-Tryptase脱颗粒组,但大于肥大细胞稳定剂组,提示肥大细胞脱颗粒剂compound48/80具有类胰蛋白酶相似的作用,但是效果较弱。套环侧除LV-RFP-siRNA稳定剂组外,其余各组动脉均狭窄均达90%以上,过表达类胰蛋白酶明显促进套环侧斑块内出血,出血率及程度远大于干扰组,compound48/80亦具有促进斑块内出血作用,但效果弱于过表达类胰蛋白酶。免疫组化染色结果显示,套环侧LV-GFP-Tryptase脱颗粒组CD31表达最高,凝血纤溶因子PAI降低,tPA升高；而LV-RFP-siRNA稳定剂组CD31表达最低,凝血纤溶因子PAI升高,tPA降低。第三部分类胰蛋白酶对小鼠微血管内皮细胞bEnd.3细胞增殖、迁移、管腔形成的影响将LV-GFP-Tryptase慢病毒及对照病毒转入小鼠肥大细胞P815细胞,并设空白对照。收集3组上清,作为条件培养液分别培养bEnd.3细胞后,检测bEnd.3细胞增殖、迁移和管腔形成能力及PAI和tPA表达。结果显示LV-GFP-Tryptase慢病毒组条件培养基培养的bEnd.3细胞增殖、迁移能力增强,管腔形成数量增多。Realtime RT-PCR和Western Blot显示LV-GFP-Tryptase慢病毒组条件培养基培养的bEnd.3细胞PAI表达降低,tPA升高。综上所述,类胰蛋白酶可促进动脉粥样硬化斑块内血管新生及斑块内出血,其机制可能与调控凝血纤溶因子有关。本研究为动脉粥样硬化易损斑块的防治提供了实验依据和新的靶点。