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目的血栓性疾病具有极高的发病率和死亡率,已经成为严重的公共健康问题之一。TM是内皮细胞广泛表达的膜蛋白,在凝血和纤溶方面起着重要作用,其抗炎和抗增值作用也已被证实。TM还是内皮损伤的标志物,心肌梗死、脑梗死、红斑狼疮、糖尿病和肾病患者的血浆中都会检测到其降解片段。TM对血栓性疾病的诊断和治疗有着重要意义。本实验旨在以pGEX-5X-3质粒为表达载体,构建含有重组质粒的E.coli BL21（DE3）菌株,诱导表达大鼠TM基因核心片段EGF4-6融合蛋白,并对其进行纯化和活性测定。方法1、PCR扩增TM核心片段通过Primer Premier 5.0软件设计大鼠TM基因核心片段EGF4-6的引物,以大鼠基因组DNA为模板,进行PCR扩增,用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并进行纯化。2、目的基因的克隆及测序将回收的PCR片段与pMD18-T simple vector连接,T-A克隆产物经Eco RI和Sal I双酶切,纯化回收后与经同样双酶切的表达载体pGEX-5X-3由T4 DNA连接酶连接,转化E.coli DH5a感受态细胞,提取质粒,酶切分析,并测序鉴定其DNA序列,将测序正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞。3、融合蛋白的诱导表达按1%比例接种至LB培养基,37℃振摇培养3h,A600约为0.5时,加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L,30℃诱导5h,分别于1h,2h,3h,4h,5h取样,用凝胶浓度为10%的SDS-PAGE检测,考马斯亮蓝R250染色,同时以含空载pGEX-5X-3质粒的E.coli BL21（DE3）及空宿主菌作为对照。4、融合蛋白的纯化将融合蛋白样品超声破碎后离心取上清通过0.45μm微孔滤膜,以0.4ml/min流速过柱。用PBS冲洗10min,流速为1.0ml/min,再用含有10mmol/L的GSH洗脱液洗脱融合蛋白,流速为1.0ml/min,洗脱10min。收集洗脱液于离心管中,于凝胶浓度为10%的SDS-PAGE检测。5、融合蛋白的活性测定取30份新鲜的大鼠血浆,每份100μl,加入部分凝血活酶100μl,分别加入按100%、75%、50%、25%、0%稀释的融合蛋白溶液,37℃预热5min,然后加入CaCl2溶液100μl,加入的同时开始计时,记录血浆凝固时间,并以同样稀释度的标签蛋白溶液作为对照。重复3组上述操作。结果1、TM基因核心片段的PCR扩增PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析,可见约556bp的目的基因片段,位置正确,条带清晰,无非特异性扩增带。PCR扩增成功。2、克隆载体与表达载体的鉴定pMD18-T simple vector大小约2700bp,将阳性克隆pMD18-T simplevector/TM经Eco RI和Sal 1分别进行单酶切,并进行双酶切,电泳检测有相应大小的目的条带,经过测序分析,编码序列与Genbank公布的一致。含目的基因的重组质粒pGEX-5X-3/TM经酶切后电泳检测,条带大小与预期大小一致,质粒构建成功。3、融合蛋白的表达及纯化经SDS-PAGE分析,重组菌所在泳道有相对分子质量约为47 000的融合蛋白表达,在温度为30℃条件下,IPTG浓度为0.5mmol/L,诱导4h时,融合蛋白的诱导表达量最高。重组蛋白主要以包涵体形式存在,经过BandScan5.0软件分析,融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的45%。利用GSTrap FF蛋白纯化预装柱得到了纯净的融合蛋白溶液。4、蛋白的活性测定以稀释度为横坐标,以3组重组质粒和空载质粒,对应凝血时间的平均值为纵坐标构建坐标图。利用SPSS统计软件,重组质粒的凝血时间与稀释度经直线回归分析有统计相关性（r=0.955,P＜0.05）,而空载质粒的凝血时间与稀释度无统计相关性（r=-0.680,P＞0.05）。克隆表达的TM基因核心片段EGF4-6融合蛋白是具有生物活性的。结论完成了引物设计和目的基因的扩增,并对PCR条件进行了优化。成功构建了克隆质粒pMD18-T simple vector/TM和重组质粒pGEX-5X-3/TM,表达菌株E.coliBL21（DE3）可以大量地表达大鼠TM基因核心片段EGF4-6,融合蛋白是具有生物学活性的。