目的:糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是终末期肾病的主因,发病率高,防治意义重大。自噬是细胞清除受损物质,避免凋亡和坏死的自稳机制,参与了早期DN中肾细胞对抗损伤的过程,所以,自噬活性是防治早期DN的新靶点之一,目前国内外研究进展不多,中医认为DN是气虚血不足而瘀,进而肾“阴阳失和”的病证,治以补气生血而化瘀,本研究以补气生血法(当归补血汤)为基础,分为理论探讨、临床研究、实验研究三部分。先在理论研究基础上,分析医疗机构中治疗早期DN的临床处方,分析当归补血汤的组成“黄芪-当归”药对的应用规律;再通过动物实验研究当归补血汤能否通过调控自噬活性治疗早期DN,并比较该方防治早期DN以补气为主,使肾精得固而“阴阳自和”的过程,与干预肾组织中miR-21靶向Akt/mTOR信号通路调控自噬保护肾脏的过程是否一致,由此揭示其药效机制,探讨自噬是否为“阴阳自和”理论的微观基础之一,为中医药防治DN研究提供思路。理论探讨:1、基于中医气血理论:补气生血法能补阳气以生阴血,起到调和阴阳,促进“阴阳自和”的作用。2、当归补血汤:是补气生血的代表方,原方主治血虚发热,重用黄芪意在针对气虚为主的病机特点,也符合早期DN的基本病机。3、自噬活性:是维持细胞内环境稳定的自我稳定机制,理论上与“阴阳自和”的核心思想异曲同工。4、基于系统生物学思维:从临床到实验研究是中医药防治疾病研究的重要方法,也是阐释中医药理论科学内涵的有效途径。方法:1、临床研究:以2017年1月到2017年12月湖北省中医院内分泌科糖尿病肾病病例为样本库,基于真实世界的研究方法,筛选处方时,选择糖尿病为主要诊断,筛选合并早期糖尿病肾病的病例,且临床有效的治疗处方,处方的录入与核对将按照上述要求进行整理,并由中医药专业人员录入“中医传承辅助系统(V2.5)”进行药物频次分析、组方规律分析和新方分析等。2、实验研究:1)体外细胞实验:分别制备正常大鼠血清(Ⅰ)、当归补血汤高剂量(7g/Kg-d)含药血清(Ⅱ)、当归补血汤低剂量(1.75g/Kg·d)含药血清(Ⅲ)、格列齐特(2mg/Kg·d)含药血清(Ⅳ)。体外培养大鼠肾足细胞分为:正常对照组(A组)、高糖组(B组)、当归补血汤高剂量组(C组)、当归补血汤低剂量组(D组)、格列齐特组(E组)。A组加Ⅰ血清+5mmol/L葡萄糖;B组加Ⅰ血清+30mmol/L葡萄糖;C组加Ⅱ 血清+30mmol/L葡萄糖;D组加Ⅲ 血清+30mmol/L葡萄糖;E组加Ⅳ 血清+30mmol/L葡萄糖。分别培养12h、24h、48h、72h后收集细胞检测。采用MTT法检测不同时段各组足细胞增殖情况,应用流式细胞仪检测不同时段各组足细胞凋亡情况,透射电镜观察足细胞自噬形态。应用Western-Bolt检测细胞中Belcin-1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ 蛋白的表达,RT-PCR分别检测Belcin-1、LC3-I和LC3-Ⅱ的mRNA表达水平。2)体内动物实验:制备当归补血汤的醇提取物,在早期DN大鼠模型造模成功后,将SD大鼠随机分为A组:空白组;B组:模型组;C组:当归补血汤高剂量组[7g/(kg·d)];D组:当归补血汤低剂量组[1.75g/(kg·d)];E组:格列奇特组[2mg/(Kg·d)]。每组10只,连续灌胃4周后取材。检测血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿白蛋白排泄率(UAER),并观察一般情况、肾脏组织病理(PAS染色),电镜观察肾足细胞的自噬体情况;Western-Blot法分析 Akt(protein kinaseB)、mTOR(mammalian target of rapamycin)的表达,RT-PCR法检测miR-21以及Akt、mTOR的mRNA表达。结果:1、临床研究:提示早期DN临床多见症状:神疲乏力、口干、浮肿、腰酸、畏寒等均为糖尿病肾病常见症状,脉象多为沉、细脉。治疗早期DN的常用药物:黄芪、当归、丹参、玄参、山药、茯苓、地黄等,当归补血汤中药对“黄芪-当归”为用药之首,用药四气特点提示温、寒为主次,五味特点甘、苦为序,用药归经频率提示脾、肝、肾、心、肺为顺序。2、实验研究:1)实验一(体外细胞实验):(1)当归补血汤能抑制高糖刺激的肾足细胞增殖,与B组比较有显著性差异(P<0.05),同时C组效果最为显著,与D、E组比较具有显著性差异(P<0.01),并且发现48h增殖情况差异性最为显著;(2)足细胞在高糖诱导下凋亡明显,不同药物干预对比提示当归补血汤高剂量组可以明显减缓凋亡,由于高糖刺激后肾足细胞损伤,出现细胞凋亡,给予药物干预后再孵育48h后,各实验组肾足细胞细胞凋亡率统计分析结果为:A组4.79%、B组39.28%、C组13.66%,D组为19.43%、E组为12.82%;(3)电镜观察相对A组,B组肾小球球囊粘连,有肾间质纤维化,自噬体减少,C、D、E组病变均较模型组轻,而且发现自噬体增多。2)实验二(体外细胞实验):经过高糖干预的肾足细胞自噬标志蛋白表达下降(P<0.05),其中当归补血汤高剂量组对自噬调控结果提示蛋白标志物Belcin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ明显增加(P<0.05),其中C组效果最为明显(P<0.01)。3)实验三(体内动物实验):(1)一般情况是A组SD大鼠动作敏捷灵活,饮食、皮毛及大小便情况均正常;B、C、D、E各组SD大鼠造模约7天开始活动减少,体重开始下降,逐渐消瘦,皮毛失去光泽,部分出现多饮、多食,多尿等表现,3周后上述表现非常突出;分组给药后的C、D、E各组情况较B组好转,给药1周后C、D组动物反应活跃,食量增加明显,毛发开始光亮,多饮改善,体重逐渐增加;(2)生化指标方面,B组和A组比较,也具有统计学意义(P<0.05),药物干预的C、D、E组均与B组比较有显著性差异(P<0.01),对比C组,E组降糖效果明显。血尿素氮、肌酐,B组和A组对比,差异有统计学意义(P<0.05),B组和A组比较,也具有统计学意义(P<0.05),药物干预的C、D、E组均与B组比较有显著性差异(P<0.01),有统计学差异;(3)肾PAS染色,A组肾脏基本正常,未见明显系膜增生或毛细血管变性。B组肾脏可见明系膜基质增生明显,局部可见球囊融合,与A组相比肾脏病变明显,且全部有病变,说明造模成功。C、D、E组肾脏可见明显病变,表现为轻重不一的肾小球、肾小管病变,系膜基质轻度增生。PAS 阳阳性区系膜基质面积变化提示与A组比较B组系膜增生明显(P<0.05),与B组比较,C、D、E各组均能改善系膜增生P<0.05),其中C组效果最好(P<0.01);(4)电镜观察,相对A组,B组肾小球球囊粘连,有肾间质纤维化,自噬体减少,C、D、E组病变均较模型组,而且发现自噬体增多,三组差别不明显;(5)Nephrin蛋白免疫荧光染色,A组足细胞裂孔蛋白Nephrin在肾小球中沿毛细血管袢呈均匀连续的线状分布,B组与A组比较Nephrin组蛋白表达减少,C、D、E组Nephrin蛋开始增加白表达,由连续线状分布变为弥散的颗粒状分布,各组之间提示与A组比较B组Nephrin蛋白明显(P<0.05),与B组比较,C、D、E各组均能改善系膜增生(P<0.05),其中C组效果最好(P<0.01)。4)实验四(体内动物实验):(1)Akt、mTOR的表达均下降,与B组比较差异有统计学意义(P<0.05),与D组比较,C组大鼠肾组织Akt、mTOR的表达有统计学意义(P<0.05)。(2)miR-21及Akt、mTOR的mRNA表达,发现B组和A组比较,差异有统计学意义(P<0.05),C、D、E组均与B组比较有显著性差异(P<0.01);就下调AktmRNA、mTORmRNA表达而言,发现B组和A组比较,差异有统计学意义(P<0.05),C、D、E组均与B组比较有显著性差异(P<0.01)。结论:1、运用数据分析软件——中医传承辅助系统(v2.5),对临床治疗DN方剂的组方用药规律进行分析,说明了治疗早期DN基本病机气虚血不足而瘀及“补气生血”而化瘀治法的综合优势,尤其符合当归补血汤中药对“黄芪胃当归”的用药特点,还可减少或避免西药的副作用,也是进一步实验研究的基础。2、实验研究:1)体外细胞实验提示高糖诱导了肾足细胞的凋亡,而肾足细胞受损是DN的病理基础之一,保护肾功能可以从保护肾足细胞入手,而补气生血法(当归补血汤)含药血清的作用在于干预了自噬体的形成,促进了肾足细胞的自我修复能力,也是维持细胞功能的基础,所以当归补血汤对足细胞保护作用的机制除影响细胞凋亡以外,还和自噬有关,高糖刺激后Beclinl、LC3-Ⅱ表达明显低于正常组,提示自噬活性受到抑制,正常状态下自噬维护细胞内环境稳定的能力下降,给予当归补血汤干预后发现自噬标志蛋白增加,提示自噬活性增强。综上所述,自噬在肾脏病中扮演着重要的角色,或许参与DN的发生、发展,而当归补血汤可能阻止高浓度葡萄糖引起的自噬活性下降,提示其通过自噬延缓DN肾损害的作用。2)体内动物实验提示足细胞的损伤和自噬活性下降,当归补血汤治疗后延迟了肾脏的这种损伤的程度,生化指标改善明显,病理结构变化及Nephrin蛋白变化提示与干预自噬有关,基于此,本研究从生化指标和病理形态上说明:补气生血法(当归补血汤)能明显改善早期DN大鼠肾功能,当归补血汤减少蛋白尿作用略优于格列齐特;同时发现当归补血汤能改善Nephrin的抑制状态,发挥减少蛋白尿作用,同时当归补血汤抑制肾组织miR-21表达,进而调控了病理状态下Akt/mTOR信号通路的失衡,保持了肾足细胞自噬活性,抑制了高糖刺激引起的肾系膜增生,起到延缓肾损害的作用,以上表明补气生血法(当归补血汤)能抑制miR-21的表达,靶向Akt/mTOR信号通路调控了肾足细胞自噬活性,这可能是其治疗治疗早期DN的重要机制之一,也说明补气生血法(当归补血汤)防治DN可能是通过调控自噬实现的,而自噬活性可能是“阴阳自和”理论的微观基础之一。