前言胰腺癌为临床较常见的恶性肿瘤，早期难以发现，晚期常有周围组织、血管神经的浸润和淋巴结转移。在肿瘤细胞的恶性增殖和转移过程中，iNOS被认为是最重要的因子之一。现已有研究表明，iNOS具有通过多种途径促进肿瘤生长、发展和转移的作用。NO作为肿瘤细胞信号转导途径中重要的信使分子，调节与细胞增殖相关基因的表达，增加肿瘤血供的血管生成，促进肿瘤生长、侵袭和转移。VEGF是参与血管生成过程的血管生成因子中，唯一能特异性地作用于血管内皮细胞的有丝分裂原，在肿瘤血管生成的各个环节中起着重要作用。VEGF对内皮细胞移行、增殖和管腔形成的作用部分是通过其诱导的信号转导分子NO来完成。研究发现VEGF与NO之间存在密切的关系。肿瘤的NO可上调VEGFmRNA水平，VEGF水平与肿瘤血管化程度正相关。因此，NO及其合酶可能是VEGF调节血管生成的下游通道和介质。近期有研究发现肿瘤相关巨噬细胞(tumour-associated macrophages，TAMs)也与淋巴结转移有密切关系。许多肿瘤组织特别是上皮组织包括肺、乳腺、胃的实体瘤内有大量的TAMs存在。TAMs主要来源于外周血单核细胞，也有一部分是固定的组织巨噬细胞。浸润的部位主要位于肿瘤的基质部和血管内皮。巨噬细胞有抗肿瘤作用，可肿瘤组织尽管有大量TAMs的浸润，却能继续生长，说明TAMs可能具有促进肿瘤生长的作用。TAMs对肿瘤组织的作用机制目前尚不完全清楚。免疫组织化学染色及微血管计数发现某些肿瘤的TAMs与血管形成有关。有研究表明食道癌中TAMs的数量和iNOS的表达有关，同时证实iNOS并和瘤周的淋巴管密度及淋巴结转移有关。但在胰腺癌中TAMs和iNOS与淋巴结转移的关系尚无报告。本实验用免疫组化方法对比进行了研究。材料与方法收集1999～2005年中国医科大学附属一院手术切除胰腺癌标本35例，其中男24例，女11例，年龄34～76岁，平均54.2岁。患者术前均未经任何治疗。所有标本均经病理证实。高分化腺癌19例，中分化腺癌9例，低分化腺癌7例。临床TNM分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期12例，Ⅲ期10例，Ⅳ期5例。有淋巴结转移15例，无淋巴结转移20例。收集了因胆管下段癌行胰十二指肠切除术而切除的正常胰腺组织6例，其中男4例，女2例，年龄39～75岁，平均58.4岁。以上标本均经过脱水，福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片(厚度4μm)。抗原修复后，常规SP法正常胰腺和胰腺癌组织免疫组化染色。鼠抗人CD68单克隆抗体标记巨噬细胞，鼠抗人iNOS单克隆抗体标记iNOS。设阳性及阴性对照，并进行常规HE染色。以光镜下随机3个癌组织高倍视野(400倍)内TAMs细胞数的均值为该病例TAMs值。iNOS的表达以其评分值表示：以癌组织染色强度评分(无，0分；弱，1分；中，2分；强，3分)和阳性细胞率评分(小于5％，0分；5～10％，1分；10～20％，2分；20～50％，3分；大于50％，4分)之和为该病例评分值，将评分值小于或等于2分定为阴性病例，大于2分定为阳性病例。用SPSS 12.0统计软件进行统计学分析，计量资料用((?)±s)表示。两组之间比较采用t(t’)检验，三组或三组以上两两比较采用方差分析(Newman-keuls法，q检验)。采用Pearson相关系数检验VEGF评分与TAMs计数之间的关系，P＜0.05有统计学意义。结果1．免疫组织化学染色结果正常组中巨噬细胞分布明显稀少，胰腺癌组中CD68表达呈黄色或棕黄色颗粒状，主要位于巨噬细胞的胞膜和胞浆。在癌组织及癌周组织广泛分布。iNOS的表达也呈黄色或棕黄色颗粒，主要位于癌细胞的胞浆中，在癌细胞中表达比较明显，在癌周围及正常组织中较少表达。2．iNOS的表达与各项临床指标的关系iNOS在胰腺癌组中的表达阳性率为54％(19／35)评分值3.17±1.22，明显高于正常组(P＜0.01)。在胰腺癌各病理分级组和临床分期组之间的差别无统计学意义(P＞0.05)。淋巴结转移组的iNOS表达高于淋巴结未转移组，差别有统计学意义(P＜0.05)。3．TAMs计数与各项临床指标的关系胰腺癌中TAMs计数均值为112.27±24.57。在胰腺癌各病理分级组和临床分期组之间的差别均有统计学意义(P＜0.05)。淋巴结转移组中TAMs计数高于淋巴结未转移组，其差别有统计学意义(P＜0.05)。4．胰腺癌中iNOS的表达与TAMs计数之间的关系在胰腺癌中iNOS的表达和巨噬细胞计数呈直线正相关关系(γ=0.551，P＜0.05)。即随肿瘤组织内巨噬细胞计数的增加，iNOS的表达也随之增加。讨论胰腺癌是较为常见的恶性肿瘤。而血管新生是恶性肿瘤生长和转移的前提。iNOS是作用较强的促血管生长因子之一。本研究显示iNOS主要表达于胰腺癌组织中，癌周和正常组织较少表达。说明胰腺癌细胞含有大量iNOS以促进肿瘤血管形成。各临床分期组和病理分级组中iNOS的表达无明显差异，而转移组iNOS表达较未转移组明显增高，说明iNOS的表达与淋巴结转移有关，提示iNOS可能通过某种机制促进淋巴管生长，导致淋巴结转移的发生。目前发现在许多肿瘤组织内有大量的巨噬细胞浸润。本研究显示胰腺癌组织中有大量肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)浸润，主要位于胰腺癌的间质中。各临床分期组和病理分级组中TAMs的表达均有明显差异，而且转移组TAMs计数均值也明显高于未转移组，说明TAMs与胰腺癌的分化转移有密切关系。TAMs也可能分泌促进肿瘤生长和转移的因子，参与肿瘤的生长和转移。TAMs计数越高，可能胰腺癌分化越低，越易发生转移。本研究还发现胰腺癌中iNOS的表达与TAMs计数呈密切正相关关系，提示iNOS的分泌与TAMs的浸润有着密切的关系，且均与胰腺癌的转移有关。而且有研究证实iNOS是TAMs浸润的诱导趋化因子。可能是癌细胞产生iNOS促进血管新生，诱导TAMs浸润，TAMs也产生iNOS促进肿瘤生长。但在胰腺癌中TAMs是否产生iNOS尚需进一步研究。本研究还发现TAMs的表达与胰腺癌的分期分级有关，iNOS的表达与胰腺癌的分期分级无关，说明iNOS和TAMs的表达是不完全相同的，可能还分别与其它因子的作用有关，而TAMs在胰腺癌的分化和转移可能会更为重要。在今后探索胰腺癌的治疗时抑制TAMs的浸润可能是一个有意义的方向。结论iNOS和TAMs的表达均与胰腺癌的淋巴结转移有密切关系，而且二者之间也存在密切联系。iNOS的表达与胰腺癌的分期分级无关，而TAMs的表达与胰腺癌的分期分级有关，说明TAMs在胰腺癌的分化和转移可能更为重要。