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目的:研究 Wnt/β-catenin信号通路在 bFGF刺激根尖牙乳头干细胞(Stem Cells from the Apical Papilla,SCAP)过程中发挥的作用。分析Wnt/β-catenin信号通路中β-连环蛋白(β-catenin),T细胞因子1(T cell factor1,TCF1),T细胞因子3(T cell factor3,TCF3),淋巴细胞增强因子1(Lymphoid enhancer factor1,LEF1)在bFGF作用SCAP增殖作用中的变化情况;明确bFGF是否通过Wnt/β-catenin信号通路调控SCAP增殖能力。 方法:实验分为三部分。实验一:通过有限稀释法克隆化培养人根尖牙乳头干细胞(SCAP);并对获得细胞进行初步鉴定:采用免疫荧光染色检测SCAP间充质干细胞标志物 STRO-1、CD24、波形丝蛋白以及角蛋白的表达情况;体外成骨成脂诱导鉴定细胞分化能力。实验二:以0,5ng/ml,10ng/ml,15ng/ml不同浓度bFGF作用SCAP2天后采用实时定量聚合酶链反应(Real Time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测基因β-catenin的表达。以15ng/mlbFGF作用 SCAP2天采用 RT-PCR检测基因TCF1,TCF3,LEF1的表达。实验三:研究在Wnt/β-catenin信号通路抑制的情况下, bFGF对 SCAP的增殖情况的影响。实验组为 Wnt/β-catenin信号通路阻断组(bFGF+Dkk1),同时设立阳性对照组bFGF(+)和阴性对照组bFGF(-)培养7天后以流式细胞术检测细胞周期及MTT比色法(四唑盐比色试验)检测SCAP的增殖情况。本实验相关实验数据结果均采用SPSS19.0数据统计分析软件统计分析。 结果:1.获得SCAP原代细胞,3天可见细胞贴壁,5天左右可见少量细胞呈集落生长,细胞形态大多呈短梭性,细胞胞浆丰富,胞体较小。2.免疫荧光鉴定细胞表面分子:小鼠抗人STRO-1抗体染色细胞胞浆呈阳性染色,胞核DAPI染色;小鼠抗人CD24抗体染色胞浆呈阳性染色,胞核呈DAPI染色;小鼠抗人波形丝蛋白抗体染色胞浆呈阳性染色,胞核呈DAPI染色;兔抗人角蛋白染色细胞胞浆无着色,呈阴性染色,胞核为DAPI染色。3.细胞多向分化能力鉴定:成骨成脂诱导3周后分别染色,可观察到有矿化结节及脂滴形成。4.SCAP在 bFGF(0)、(5ng/ml)、(10ng/ml)和(15ng/ml)的完全培养基培养2天后,RT-PCR检测基因表达的结果:bFGF(15ng/ml)上调了β-catenin基因的表达(P<0.05);SCAP在bFGF(0)和bFGF(15ng/ml)的完全培养基培养2天后,RT-PCR检测基因表达的结果:bFGF上调了TCF1,TCF3和LEF1基因的表达,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。5.细胞增殖能力的检测:(1).MTT法检测细胞增殖得出:与对照组相比,bFGF可促进SCAP增殖(P<0.05),利用Dkk1阻断Wnt/β-catenin信号通路后,bFGF对 SCAP增殖能力减弱,与bFGF组比较结果无统计学意义(P>0.05);与阴性对照组比较增殖能力增强(P<0.05)。(2).流式细胞仪检测细胞周期:bFGF(-)组细胞G1期(83.7%),G2期(6%),S期(10.3%),bFGF(+)组细胞G1期(74.8%),G2期(6.1%),S期(19.1%),bFGF(+)+Dkk1组细胞 G1期(80.8%),G2期(4.5%),S期(14.7%)。bFGF刺激SCAP后细胞S期,G1期高于对照组(P<0.05);与bFGF(+)组相比,阻断Wnt/β-catenin信号通路后,bFGF下调了SCAP细胞S期,G1期的数值(P>0.05);与bFGF(-)组细胞比较,阻断Wnt/β-catenin信号通路后,bFGF对上调了细胞S期,G1期的数值(P>0.05)。 结论:1.成功分离培养了根尖牙乳头干细胞。2.bFGF作用 SCAP可激活 Wnt/β-catenin信号通路,促进关键分子β-catenin以及下游分子TCF1,TCF3和LEF1基因的表达。3.bFGF通过激活Wnt/β-catenin信号通路调控SCAP增殖。