论文部分内容阅读
背景：钙化性主动脉瓣疾病(CAVD, Calcific aortic valve disease)是一类常见的心血管疾病,其发病率随着年龄增长而升高,属于年龄相关的退行性病变。瓣膜组织纤维化与钙化是钙化性主动脉瓣疾病核心病理学改变。进一步研究发现瓣膜组织纤维化的过程包括瓣膜间质细胞(VICs, valve interstitial cells)向肌纤维母细胞转分化、细胞外基质异常沉积和基质金属蛋白酶(MMPs,Matrix metalloproteinase)及其特异性抑制因子(TIMPs, Tissue inhibitors of metalloproteinase)表达失衡导致的瓣膜基质重塑；瓣膜组织钙化的过程则包括基于瓣膜间质细胞凋亡的被动性钙盐沉积和基于瓣膜间质细胞向骨母细胞表型转化并表达成骨基因和成骨基质的主动性骨形成。氧化应激(Oxidative stress)损伤在钙化性主动脉瓣疾病发病机制中的研究成为近年来的热点,其中过氧化氢导致的氧化应激损伤在钙化性瓣膜疾病发展中所起的作用也受到越来越多的关注。生理状态下过氧化氢维持低浓度,约为0.1-0.2μ M,而在病理状态下过氧化氢浓度可达100-200μM。多个研究小组在钙化瓣膜中检测到大量过氧化氢,而且体内外钙化模型均证实在瓣膜钙化过程中产生大量以过氧化氢为代表的活性氧,提示过氧化氢介导的氧化应激参与瓣膜纤维钙化的发生。目的：基于以上理论研究背景,当前对具有种属特异性的人瓣膜间质细胞生物学特性及生物学行为改变研究尚处在初步阶段,为此,本课题目的旨在：1.建立过氧化氢介导的人瓣膜间质细胞氧化应激模型；2.探讨过氧化氢介导的氧化应激促进瓣膜纤维化的分子机制；3.探讨过氧化氢介导的氧化应激促进瓣膜钙化的分子机制。方法：为此,本研究将从以下三个部分展开。1.过氧化氢诱导瓣膜间质细胞产生氧化应激模型的建立:采用两步酶消化法分离瓣膜间质细胞,种入培养板中于适合环境下培养。光学显微镜下动态观察瓣膜间质细胞形态；给予不同浓度的过氧化氢处理瓣膜间质细胞,苏木素-伊红染色(Hematoxylin and Eosin stain,HE)观察过氧化氢处理后瓣膜间质细胞形态学改变；MTT比色法检测过氧化氢对瓣膜间质细胞存活能力的影响。2.过氧化氢介导的氧化应激促进瓣膜纤维化的分子机制研究:不同浓度过氧化氢处理瓣膜间质细胞,qRT-PCR检测α-平滑肌肌动蛋白(β-Smooth muscle actin, a-SMA)表达情况评价过氧化氢诱导瓣膜间质细胞向肌纤维母细胞转分化能力,并通过划痕实验评价过氧化氢对瓣膜间质细胞收缩迁移能力的影响；于不同时间点(1周、2周、3周、4周)收集细胞mRNA,反转录后用qRT-PCR检测细胞外基质基因和MMPs、TIMPs mRNA的表达情况,并计算其相对表达量。3..过氧化氢分导的氧化应激促进瓣膜钙化的分子机制研究:不同浓度过氧化氢处理瓣膜间质细胞,应用脱氧核糖核营酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)观察细胞凋亡形态,应用Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率；不同浓度过氧化氢处理瓣膜间质细胞,并于不同时间点收集细胞nRNA,反转录后用qRT-PCR检测凋亡相关基因mRNA和成骨相关基因mRNA的表达情况,并计算其相对表达量。结果：1.过氧化氢诱导瓣膜间质细胞产生氧化应激模型的建立:两步酶消化法能成功分离人瓣膜间质细胞,且细胞得率较高。细胞早期呈球形、杆状或梭状,稍有伪足伸出,随着培养时间延长,伪足增多、伸长,可相互融合,此时细胞呈星状；过氧化氢处理后,HE染色见对照组胞浆丰富染为淡红色,边界清楚,细胞核淡蓝染,核仁清晰可见,100-500μ mol/L处理组细胞形态相比对照组无明显改变,>800μ mol/L处理组细胞胞浆浓缩染色加深,伪足减少变细,细胞核固缩染为蓝黑色,核仁不可辨认,1000μ mol/L处理组细胞大片坏死脱落；MTT比色法显示过氧化氢浓度在0-100μ mol/L细胞相对存活力稍有升高(p<0.05),随后细胞相对存活力随过氧化氢浓度升高开始下降,在800μ mol/L时有个快速降低的拐点,此时细胞相对存活力为69%(69.8±8.3, n=6),1000μmol/L时,细胞相对存活力降为14%(14.3±11.0,n=6)。2.过氧化氢介导的氧化应激促进瓣膜纤维化的分子机制研究:过氧化氢处理组肌纤维母细胞特异性标志物a-SMA表达量较对照组明显升高(P<0.05)；划痕实验显示低浓度过氧化氢(<100μ mol/L)处理后细胞迁移能力较对照组明显增强(P<0.01),中、高浓度过氧化氢(500-800μ mol/L)处理后细胞迁移能力较对照组明显减弱(P<0.05)；Collagen Ⅰ mRNA表达水平在处理第3周和第4周时较对照组明显升高(P<0.05),Collagen Ⅲ mRNA表达水平也在处理第3周和第4周时较对照组明显升高(P<0.05),Fibronectin mRNA相对表达量均在处理第4周时较对照组明显升高(P<0.05)；MMP-3mRNA表达水平在处理3周和4周时表达水平较对照组明显下降(P<0.05),其特异性抑制因子TIMP-1随处则在处理第4周时表达水平明显升高(P<0.05)。3.过氧化氢介导的氧化应激促进瓣膜钙化的分子机制研究：TUNEL染色显示在过氧化氢浓度达500μ mol/L时TUNEL染色阳性细胞开始明显增多,800μ mol/L寸几乎所有细胞均为TUNEL染色阳性；Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率发现：对照组细胞凋亡率为2.85%(2.85±0.69%),300μ mol/L处理组细胞凋亡率为6.04%(6.04±0.17%);500μ mol/L处理组凋亡率为6.85%(6.85±0.50%),800μ mol/L处理组细胞出现明显凋亡,总凋亡率为22.76%(22.76±0.94%),过氧化氢处理浓度大于300μ mol/L时细胞凋亡率均较对照组明显升高(P<0.01); qRT-PCR显示：处理早期c-fos mRNA相对表达量已明显下降(p<0.05),且与处理浓度正相关,处理后期Bax、caspase-3和P53表达水平较对照组明显升高(p<0.05),与处理浓度也呈正相关；在处理后期Runx2、 osteocalcin和osteoponin等成骨相关基因表达水平较对照组明显升高(p<0.05),且200μ mol/L的低浓度处理组较400μ mol/L的较高浓度处理组升高更为明显。结论：1.两步酶消化法能成功分离并培养瓣膜间质细胞,方法简便可行,细胞得率较高,细胞形态均一性较好,生长特性稳定,可连续传代。2.过氧化氢对瓣膜间质细胞活性有影响；0-100μmol/L低浓度过氧化氢提升瓣膜间质细胞存活力并促进其增殖；100-800μmol/L中等浓度过氧化氢对瓣膜间质细胞存活力中等抑制；大于800μmol/L的高浓度过氧化氢导致瓣膜间质细胞大量坏死脱落。3.过氧化氢介导的氧化应激能激活瓣膜间质细胞并使其向肌纤维母细胞转分化并上调其特异标志物α-SMA的表达。4.低浓度(100μmol/L)的过氧化氢能提升瓣膜间质细胞收缩迁移能力,而高浓度(>500μmol/L)过氧化氢则抑制瓣膜间质细胞收缩迁移。5.过氧化氢介导的氧化应激能诱导瓣膜间质细胞向肌纤维母细胞表型转化,转化后的肌纤维母细胞通过上调Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和Fibronectin的表达水平参与瓣膜纤维化。6. MMP-3表达水平的降低有可能是促进细胞外基质异常沉积的原因,而随处理时间延长其特异抑制物TIMP-1表达水平升高也可能是协同促进细胞外基质沉积进而导致瓣膜纤维化的重要原因。7.过氧化氢能诱导瓣膜间质细胞凋亡,其诱导能力呈浓度依赖性,浓度小于500μmol/L诱导凋亡能力较弱,浓度达800μ mol/L诱导凋亡能力较强。8.过氧化氢诱导瓣膜间质细胞凋亡的分子机制可能是在处理早期通过抑制促增殖基因c-fos表达,随着处理时间延长,一方面通过继续抑制c-fos表达,另一方面通过促进Bax、caspase-3和P53等促凋亡基因表达促进凋亡。9.200μmol/L处理组过氧化氢诱导瓣膜间质细胞向成骨细胞表型转化能力较400μmol/L处理组强,且作用呈时间依赖性,随处理时间延长上游成骨基因Runx2表达上调,进而促进下游osteocalcin和osteoponin等成骨相关基质基因表达促进瓣膜钙化。