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RAS GTP酶超家族参与了很多细胞过程,包括细胞生长的控制,基因表达,细胞骨架的重排,微管的组织,膜泡和核的转运,细胞的生存以及细胞内的信号调节等过程,它们和人类的多种疾病特别是恶性肿瘤相关。RAS超家族共分成五个亚家族,它们分别是Ras,Rho,Rab,Ran和Arf。其中Rho亚家族GTP酶参与了细胞骨架的构建,基因表达和酶活性的调节等很多关键步骤。它们和其它RAS超家族的成员一样,通过结合GTP或者GDP而起到分子开关的作用。当形成GTP结合状态时Rho GTP酶处于活性状态,而和GDP结合时则处于非活性状态。Rho GTP酶在这两种状态之间的转换依赖于一些调节因子。RhoGDIs(RhoGDP-Dissociation Inhibitors,Rho GTP酶的GDP解离抑制因子)是其中一类非常关键的调节因子。RhoGDIs的主要功能是抑制GDP从Rho GTP酶上解离下来,使后者处于非活性状态。Rho GTP酶在Rho-ROCK,JNK等信号途径中起着关键的作用。因此,它们在活性和非活性两种状态之间的平衡显得非常重要。已经有大量的实验证明,RhoGTP酶(如RhoC,RhoA,Rac1,CDC42等)的过度表达和活化会启动基因转录,促进细胞分裂,导致细胞生长和迁移的能力大大增强,从而使细胞发生癌变。另外一些研究表明,在休眠的细胞中,大部分Rho GTP酶处于GDP结合的非活性状态,在细胞质中以和RhoGDIs形成复合物的形式存在。由此可见,Rho GTP酶维持在非活性状态对于细胞维持正常的生理和生物学功能很关键。RhoGDI2是RhoGDIs家族的一个成员,它作为Rho GTP酶关键的活性调节因子之一,也得到了人们普遍的重视。近年来人们陆续发现RhoGDI2和肿瘤的发生和转移有关。Gildea等在2002年底第一次发现并用实验证明了在人类膀胱癌中RhoGDI2起抑制肿瘤转移的作用,引起了人们极大的关注。但是该基因和肿瘤的关系从目前看来还很扑朔迷离。有些研究认为RhoGDI2在乳腺癌,人骨肉瘤细胞癌,口腔上皮癌和卵巢癌中表达升高,张等在2006年6月发现RhoGDI2在乳腺癌中促进了肿瘤浸润。而另外一些研究则证明RhoGDI2可以在膀胱癌和直肠癌细胞株中起到抑制肿瘤转移的功能。RhoGDI2和肿瘤之间关系的研究才刚刚起步,越来越多的人对这个基因发生兴趣。本文中我们首先根据已有RhoGDI2的文献以及晶体结构分析的报道,挑选了7个可能和RhoGDI2的GDP解离抑制因子功能相关的位点,采用体外定点突变的方法,分别制备了7个不同的RhoGDI2定点突变体。体外表达纯化野生型RhoGDI2和定点突变体蛋白质后,分别检测了它们和RhoA的结合能力,以及它们抑制RhoA的GDP解离的功能的变化。和RhoA的结合实验表明,其中一个突变体LL(52,53)SS和RhoA的结合能力明显下降,其它6个突变体的结合能力则没有明显的降低。GDP解离抑制实验的结果显示所得到的7个定点突变体的GDP解离抑制能力下降都很明显。最为突出的是SL(44,45)AA,LL(52,53)SS,DD(181,182)AA,这三个定点突变体的GDP解离抑制功能几乎完全消失。RhoGDIs家族的保守性非常高,因此这个结果可能提示我们,RhoGDI2蛋白质活性对其氨基酸序列和空间结构的要求很严格,故某些甚至1个重要位点发生突变都易导致其功能的减弱或消失。另外,为了了解RhoGDI2与乳腺癌的相关性,我们在5个转移能力不同的乳腺癌细胞株和71例乳腺癌病人组织中检测了RhoGDI2蛋白质的表达水平。肿瘤组织切片的免疫组化和细胞学研究的结果一致表明RhoGDI2的表达随着细胞从正常到转移这一系列过程中呈现出先升高后降低的现象。表明该基因和人乳腺癌的发生和转移可能都有关系。此外,在20例肿瘤新鲜组织中,我们用半定量RT-PCR的方法初步探索了包括RhoC,CDC42,Rac2和Rac3在内的4种Rho GTP酶的表达变化。比较了每一例病人正常和肿瘤组织中各种Rho GTP酶的表达水平的差异后,发现RhoC在肿瘤组织中的表达要明显高于正常组织(87.5%),这和文献报道的结果一致。Rac2和CDC42的表达在我们的初步检测中并未发现有明显的规律。然而,我们发现Rac3在17例肿瘤组织中的表达升高非常明显。从Rac3获得的初步结果提示我们这个基因也许可以成为检测肿瘤的marker和治疗肿瘤的靶点之一,值得做进一步的研究。RAS家族是个巨大的家族,已有很多研究表明这个家族的成员和肿瘤的发生和转移相关。我们在搜索NCBI数据库时发现了一个未被鉴定过的RAS基因RasL10B。生物信息学分析提示我们该基因极可能和肿瘤抑制相关。因此我们从人白细胞cDNA文库中分离和鉴定了这个基因,做了一些初步的功能分析,并在正常乳腺细胞株和乳腺痛细胞株中检测和比较了RasL10B mRNA的表达水平。结果显示,RasL10B定位于染色体17q12,编码203个氨基酸,分子量大约为23.2 kD。我们将其编码区克隆到大肠杆菌表达质粒pET30a中,在大肠杆菌Rosette(DE3)中表达了RasL10B蛋白质后,用His-tag亲和层析柱纯化得到少量纯化的蛋白质,为以后的研究做了一些材料和方法上的摸索。人的7种组织表达谱分析表明,RasL10B在这些组织中广泛表达,但是表达量有差别,其中大脑,胰,胸腺和前列腺组织中表达较高。COS7细胞的亚细胞定位结果表明,该蛋白质主要定位在细胞质中。最后,我们在人类乳腺痛细胞株MCF-7,MDA-MB-468,MDA-MB-231和MDA-MB-435中和正常的乳腺细胞株HBL100中用半定量RT-PCR的方法检测了RasL10B的表达水平,发现RasL10B在所有这4种人乳腺癌细胞株中表达均被下调。这一结果表明了该蛋白质可能是RAS家族Ras亚家族中一个具有肿瘤抑制能力的新成员。