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海藻糖因其稳定性好和对生物大分子具有非特异性保护作用等特点,近年来在食品、医药、农业等行业中被广泛使用。目前,工业上海藻糖的生产方法主要包括化学合成法、微生物发酵法、微生物抽提法、酶转化法和转基因法等。在酶转化法中,海藻糖合酶能一步催化麦芽糖生成海藻糖,由于具有工艺流程短、易调控、生产原料低廉等优点,从而在工业生产中具有较高的开发应用价值。本文将一种来源于60℃、pH0.7环境中的耐热嗜酸古菌(Picrophilus torridus)的海藻糖合酶基因分别在大肠杆菌和毕赤酵母中进行克隆表达,并探索了一种快速简单高效的海藻糖合酶固定化方法。主要研究工作如下:1.依照大肠杆菌密码子偏好性,将海藻糖合酶基因(GenBank:AE017261)进行优化,合成了一段基因大小为1677 bp的海藻糖合酶(TreS)片段。在两端设计的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点双酶切后,连接至pET-28a(+)载体上,构建得表达质粒pET-28a(+)-TreS,并转化在大肠杆菌BL21,得到大肠杆菌工程菌株。该工程菌诱导表达重组蛋白的分子量约为65 kDa,诱导剂IPTG的最适添加量0.1 mmol/L,最适诱导温度20℃,最适诱导时间12 h;薄层色谱(TLC)结果说明重组菌株经诱导后的粗酶液具有催化麦芽糖生成海藻糖的酶活性;将粗酶液纯化后,高效液相色谱(HPLC)结果进一步说明纯化酶也具有催化麦芽糖生成海藻糖的能力。2.为研究不同表达系统对产物表达水平的影响,利用Gibson法将该海藻糖合酶片段连接到质粒pPICZαA的EcoRⅠ位点上,构建表达载体pPICZαA-TreS,同源重组到毕赤酵母GS115基因组中,筛选出高拷贝菌株后,利用甲醇进行诱导表达,TLC结果表明在毕赤酵母胞内和胞外都检测到海藻糖合酶活性。3.利用壳聚糖作为载体,对大肠杆菌表达纯化后的海藻糖合酶进行固定化。单因素试验结果表明,最适海藻糖合酶加入量为32 mg/g(壳聚糖),最适吸附时间为2.5 h;经过9次重复试验,固定化酶酶活残留率为64.64%;与游离酶相比,固定化酶温度稳定性没有明显变化,但酸碱稳定性优于游离酶;反应进程试验结果表明,该固定化酶在反应2 h时,海藻糖得率达最大61.4%。