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天然免疫系统通过对病原相关分子模式(PAMPs)的持续监测,进而激活一系列防御机制来消除感染,是抵抗病原体的第一道防线。天然免疫细胞表达各种模式识别受体(PRRs)负责识别微生物的PAMPs,其中Toll样受体(TLRs)是一类重要的PRRs,在天然免疫系统中起着重要作用。TLR5作为TLR家族的一员,能够识别细菌鞭毛蛋白。鞭毛蛋白与TLR5结合后依赖接头蛋白MyD88进行信号传导,可以激活NF-κB和MAPK信号通路,导致下游炎性细胞因子和趋化因子的表达,在机体抵抗细菌感染中发挥重要的作用。一些研究表明,鞭毛蛋白激活TLR5后,还可能抑制病毒的复制。本研究从猪源细胞中克隆出TLR5,构建真核表达质粒鉴定其蛋白表达及信号功能;另外构建猪TLR5和信号接头蛋白MyD88基因敲除细胞系以及猪TLR5过表达细胞系,结合细胞转染方法研究猪TLR5(pTLR5)和猪MyD88(pMyD88)的细胞信号功能和抗病原微生物作用。主要研究内容如下:1 pTLR5基因克隆、蛋白表达及信号功能从PAM细胞总 RNA 中RT-PCR扩增 pTLR5 基因,构建重组pENTR4-pTLR5-3FLAG中间穿梭质粒。将鉴定为阳性的pENTR4-pTLR5-3FLAG中间质粒和真核表达目的载体pDEST47进行位点特异重组(LR)反应,获得重组pcDNA-pTLR5-3FLAG 真核表达质粒。pcDNA-pTLR5-3FLAG 转染 293T 细胞后 Western Blotting检测其蛋白表达,大小约为100KDa。RT-PCR实验表明pTLR5能够介导细菌鞭毛蛋白刺激转染细胞引起下游基因IFN-β和IL-8的表达升高。2 pTLR5和pMyD88抗猪大肠杆菌作用利用CRISPR-Cas9技术分别设计pTLR5和pMyD88的gRNAs。gRNAs分别与慢病毒载体pLentiCRISPRv2连接得到gRNA重组病毒质粒。包装表达gRNA慢病毒感染PK15细胞,经2μg/mL的嘌呤霉素筛选后获得稳定敲除(KO)细胞系。同时pENTR4-pTLR5-3FLAG质粒和pLentiCMV DEST puro目的慢病毒载体进行LR反应,获得慢病毒表达质粒plenti-CMV-pTLR5-3FLAG。包装病毒感染PK15细胞,嘌呤霉素筛选后获得pTLR5过表达(OE)PK15稳定细胞系。此外,将构建的表达质粒pEGFP-pMyD88转染或与pcDNA-pTLR5-3FLAG共转染PK15细胞。上述细胞分别用鞭毛蛋白和猪大肠杆菌O20进行刺激,定量RT-PCR检测细胞下游基因表达和细菌培养计数分析细菌增殖。TLR5 KO和MyD88 KO PK15细胞中,鞭毛蛋白和大肠杆菌诱导的下游基因包括炎性因子和干扰素刺激基因(ISG)表达水平降低,而细菌的增殖明显上升。而在TLR5和MyD88 OE细胞中,鞭毛蛋白和大肠杆菌诱导的下游基因包括炎性因子和干扰素刺激基因表达水平升高,但细菌的增殖明显降低。3 pTLR5和pMyD88抗鼠伤寒沙门氏菌作用CRISPR gRNA病毒感染PAM细胞,经1 μg/mL的嘌呤霉素筛选后获得pTLR5 KO PAM和MyD88 KO PAM稳定细胞系。同时pTLR5-3FLAG慢病毒感染PAM细胞,嘌呤霉素筛选后获得pTLR5 OE PAM稳定细胞系。此外,将构建的表达质粒pEGFP-pMyD88转染或与pcDNA-pTLR5-3FLAG共转染PAM细胞。上述细胞分别用鞭毛蛋白和鼠伤寒沙门氏菌进行刺激,定量RT-PCR检测细胞下游基因表达和细菌培养计数分析细菌增殖。在TLR5 KO和MyD88 KO PAM细胞中,鞭毛蛋白和鼠伤寒沙门氏菌诱导的下游基因包括炎性因子和ISG表达水平降低,而细菌的增殖明显上升。而在TLR5和MyD88 OE PAM细胞中,鞭毛蛋白和鼠伤寒沙门氏菌诱导的下游基因包括炎性因子和ISG表达水平升高,但细菌的增殖明显降低。4pTLR5和pMyD88抗猪流感病毒作用上述 pTLR5 KO、pMyD88 KO 稳定 PAM 细胞、pTLR5 OE 稳定 PAM 细胞、pMyD88转染、pTLR5和pMyD88共转染PAM细胞,分别用于猪流感病毒H9N2-C1感染刺激。定量RT-PCR检测细胞下游基因的表达和H9N2病毒复制基因表达。pTLR5 KO、pMyD88KO稳定PAM细胞中,细胞下游基因的表达水平降低,病毒HA和M基因的表达上升。pTLR5 OE稳定PAM细胞和pMyD88转染PAM细胞中,病毒诱导下游基因的表达水平上升,病毒H9N2复制水平降低。pTLR5和pMyD88共转染PAM细胞中,与单独转染相对照,病毒复制水平进一步降低。这些结果说明猪TLR5-MyD88不仅有抗细菌作用,也发挥抗病毒作用。