研究背景：脑出血(Intracerebral hemorrhage, ICH)是一种高发病率、高死亡率和高致残率的疾病。世界范围内脑出血发病率虽仅占脑卒中总数10-15%,但它是脑卒中疾病中最严重的亚型；其30天的死亡率约为43～51%,致残率为80%-95%,只有少数患者能够恢复至生活自理。脑出血后,血肿周围损伤组织水肿的发生、发展是导致患者神经功能缺损、死亡、残疾的主要原因,并且脑水肿的程度与患者预后密切相关。脑出血后脑水肿主要是血管源性脑水肿和细胞毒性脑水肿共同作用的结果。血脑屏障(Blood brain barrier, BBB)是维持中枢神经系统内环境稳定的重要结构,主要由脑毛细血管内皮细胞及其间紧密连接蛋白、内皮基底膜、周细胞和星形胶质细胞终足等构成。BBB结构与功能的破坏是脑出血后血管源性脑水肿形成的主要原因。内皮细胞间的紧密连接蛋白是维持BBB结构与功能完整的关键结构,构成紧密连接的蛋白分子主要包括：跨膜蛋白(occludins, claudins, junction associated molecules (JAM)和胞浆蛋白zonulaoccludens (ZO), cingulin, AF-6 and 7H6)。紧密连接蛋白一旦破坏,可直接引起BBB的通透性增加,从而导致脑水肿的发生。红细胞是脑出血后颅内血肿的主要成分,其裂解产物血红蛋白(Hemoglobin, Hb,主要由珠蛋白和血红素组成)是脑出血后一种很强的氧化应激介质。研究证实,在脑出血的早期即有血红蛋白被释放入周围脑实质中,且释放的血红蛋白与BBB通透性增加及脑水肿的发生密切相关。但是血红蛋白破坏BBB及介导脑水肿形成的具体机制仍不清楚。一氧化氮(Nitric oxide, NO)是一种具有双重作用的调节分子,由一氧化氮合酶(主要包括神经元型一氧化氮合酶(neuronal NOS, nNOS),诱导型一氧化氮合酶(inducible NOS, iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS, eNOS))以L-精氨酸为底物合成。有报道显示在病理情况下,如脑缺血、颅内感染及蛛网膜下腔出血中,大量产生的NO可以介导BBB结构及功能破坏。但更重要的是,在氧化应激情况下,NO与超氧阴离子(O2-)所形成的代谢产物过氧化亚硝酸盐(ONOO-)是一种毒性更大、破坏性更强的氧化硝化产物。在多种中枢神经系统疾病,如脑缺血、脑栓塞、创伤性脑损伤、多发性硬化及急性细菌性脑膜炎等中,大量产生的ONOO可导致明显的BBB功能障碍。通过治疗药物或清除剂,针对性减少ONOO水平,不仅能够防止神经元死亡,而且还能恢复BBB的完整性。此外,也有研究证实,在很多情况下,NO的细胞毒性主要取决于ONOO的产生,ONOO可通过使酪氨酸残基硝化或者通过S-亚硝基化机制,来氧化修饰体内生物大分子物质,如脂质、蛋白质和核酸等,从而介导内皮细胞损伤、BBB破坏、脑水肿形成及神经元坏死与凋亡。基质金属蛋白酶(Matrix metaUopeptidases, MMPs)是一类锌离子依赖性蛋白酶,具有多种生物学活性。目前已知的哺乳动物体内MMPs约有24种,其中,基质金属蛋白酶-9(MMP-9)与脑出血后神经功能缺损及脑水肿的产生密切相关。研究发现,血红蛋白、凝血酶及氧化应激等因素均可激活MMP-9,活化的MMP-9可降解血管基膜及内皮细胞间紧密连接蛋白,引起血脑屏障通透性增加,从而导致脑水肿。据体内外实验报道,几种金属卟啉能够催化分解ONOO,从而减轻其毒性效果。由于其重要性,ONOO清除剂现已被广泛用于多种领域,比如心脏、肺、肝脏、肾脏、肠道及其它内脏性缺损再灌注损伤。FeTPPS (5,10,15,20-Tetrakis (4-sulfonatophenyl)porphyrinato Iron (Ⅲ), Chloride)是金属卟啉类中的代表性成员之一,它能够将ONOO催化为无害的硝酸盐离子,从而减轻大量ONOO产生所介导的组织、细胞损伤。目的：本研究通过建立Hb模拟的大鼠脑出血模型：1.检测不同时间点脑组织中三种NOS表达和ONOO生成变化、紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1的表达变化、脑含水量及大鼠行为学变化,探究Hb对BBB、脑含水量及神经功能的影响,并进一步分析NOS和ONOO在此过程中的作用；2.针对产生的毒性产物ONOO-,予以干预剂FeTPPS清除,观察大鼠损伤脑组织紧密连接蛋白ZO-1、基质金属蛋白酶MMP-9活性及神经功能变化情况,为脑出血临床治疗提供新的参考依据。实验方法：1、实验分组及模型制作实验一成年雄性SD大鼠,SPF级,体重为280-300g,随机分为正常组、假手术组和Hb组。造模成功后,假手术组和Hb组观察、取材时间点依次为6h、12h、24h、 48h、3d和7d,共6个亚组。实验二取相同体重相同来源的大鼠,随机分为假手术组、对照组(Hb+生理盐水组)、实验组(Hb+FeTPPS治疗组)。给药方式：实验组在不同时间点(Hb注入后立即,12h,36h,60h)腹腔注射FeTPPS (30mg/kg);对照组在同样的时间点以同样的方式给予生理盐水作安慰剂对照。在立体定向仪辅助下,向大鼠右侧尾状核注射血红蛋白溶液(20ul,150 g/L),制成大鼠脑内Hb注入模型。假手术组大鼠同法在相同位置仅做单纯穿刺。2、脑组织水含量测定分别在造模后不同时间点麻醉大鼠、断头取脑,沿中线切开左右两侧大脑半球,去除小脑和脑干后,用电子分析天平分别称量双侧半球湿重。将脑组织放入烤箱中烘烤(100℃,持续24h),再次用电子天平称其干重。脑组织含水量(%)=[(湿重一干重)/湿重]×100%。3、行为学检测采用改良神经功能缺损程度评分方法(mNSS)在术后不同时间点(6h、12h、 24h、48h、3d、7d和14d)分别对其进行评分,包括运动、感觉、反射、平衡等方面。得分越高提示神经功能损伤越重：总分18分,13-18分重度受损；7-12分中度受损；1-6分轻度受损。4、Western Blot方法检测蛋白表达变化大鼠深度麻醉后,断头取脑,取Hb损伤处及周围脑组织约100mg,-80℃冰箱或液氮中保存备用。组织标本经匀浆、裂解、超声破碎、离心后,采用Bradford法蛋白定量。蛋白裂解液依次经过电泳、转膜、孵育一抗及二抗、显影及定影。凝胶成像系统扫描并分析nNOS、iNOS、eNOS、claudin-5、ZO-1、3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)蛋白表达变化。5、ELISA法检测组织及血清中3-硝基酪氨酸变化麻醉大鼠后,打开胸腔,心脏穿刺抽取2m1全血,室温下静置2小时,离心(4000转,10分钟)取上清,储存于-80℃冰箱备用。同时,断头取脑,取Hb损伤处周围脑组织约100mg,加入等量生理盐水捣碎、匀浆,3000转离心30分钟取上清,同法储存备用。Elisa检测方法如下：往预先包被3-NT抗体的微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤,然后底物TMB显色。用多功能酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD)值,计算样品浓度。6、脑组织石蜡切片制作麻醉大鼠后并固定,先后用生理盐水和4%多聚甲醛溶液行心脏灌注。切取损伤处脑组织,于4%多聚甲醛溶液中浸泡24小时后,按照常规石蜡包埋法制成石蜡标本并切片,切片厚度为3-5umm,捞片、风干后备用。7、免疫组化组织切片经脱蜡、水化,在柠檬酸缓冲液(0.01 mol/L)中给予微波热修复25-30min。冷却至室温后,依次给予0.3%H202溶液、山羊血清、一抗、生物素化二抗和辣根酶标记链霉卵白素工作液封闭、孵育。DAB显色液(1：20)显色后,二甲苯透明、中性树胶封片,在显微镜下观察并拍照。8、免疫荧光石蜡切片脱蜡至水,在Tris-EDTA (PH 8.5)或柠檬酸缓冲液(0.01 mol/L)中给予微波热修复25-30min,血清封闭后滴加一抗,4℃孵育12-24h, PBS溶液冲洗后滴加相应荧光二抗,37℃孵育1h。荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察、拍照、分析。9、血清中NO含量测定血清制备方法同Elisa检测。按照硝酸还原酶法测定血清中NO含量,NO含量表示为umol/L。10、MMP-9原位明胶酶谱法及荧光双标制备10umm厚的损伤处脑组织快速冰冻切片备用,按照冰冻切片基质金属蛋白酶9(MMP-9)原位明胶酶谱法荧光染色试剂盒说明书方法(杰美基因)检测损伤脑组织MMP-9活性。取适当明胶荧光底物孵育新鲜组织切片(先4℃10mmin, 后37℃,1 h),直接观察、拍照(激发波长480nm,发射波长530nm)。观察后,PBS冲洗切片,依次孵育一抗、二抗,共聚焦显微镜下观察、拍照、分析。11、统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析,计量资料用均数±标准差(mean± SD)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用ONE-WAY方差分析,多重比较用LSD-t检验。3-NT水平与脑水含量和神经功能缺损之间的相关性采用Spearman失相关分析,以P<0.05为差异有统计学意义。实验结果：实验一1、Hb注入后不同时间点脑水含量变化。Hb组损伤对侧脑组织,各个时间点脑水含量均未见明显变化。然而,Hb损伤同侧脑组织水含量从6h开始逐渐升高,24h达到最大值,维持在较高水平直至3d,后逐渐下降。Hb损伤同侧脑组织在各时间点脑水含量均明显高于正常对照组和损伤对侧脑组织,差异有统计学意义(P<0.05)。2、Hb注入后不同时间点大鼠行为学变化。mNSS评分表明,与正常对照组和假手术组比较,注入Hb后6h大鼠神经功能缺损逐渐加重,24 h达到峰值,维持在较高水平直至3d,后逐渐恢复。从6h至7d Hb组大鼠神经功能缺损均明显高于正常对照组和假手术组,差异有统计学意义(P<0.05)；在14d时,大鼠mNSS评分基本恢复正常,差异无统计学意义(P>0.05)。3、Hb注入后,三种NOS在蛋白水平的变化趋势。Westernblot检测表明HB注入后,nNOS表达是升高的,各时间点与假手术组之间均有统计学差异,但其趋势变异性较大,3d时表达最高(P<0.001)；注入Hb后iNOS表达急剧升高,6h即达到最高峰,后持续在高水平直至24h(P<0.001),然后逐渐降低,且变异性大；与iNOS和iNOS相比,eNOS在Hb注入后也表达明显升高,从6h至24h,一直维持在较高水平,12h达到峰值(P<0.001),后呈现不同程度的降低。4、Hb注入后紧密连接蛋白claudin-5/ZO-1的表达、分布变化。Westernblot检测表明,与假手术组相比,Hb组claudin-5蛋白表达在12h (P< 0.05),3d (P< 0.001),7d (P< 0.001)均明显降低；而其余的时间点与假手术组相比无统计学差异。同样地,免疫荧光观察显示假手术组的血管内皮细胞间紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1表达完整,并呈连续条带状分布；而Hb组中,claudin-5和ZO-1的表达明显减少且分布弥散、不连续。5、硝酸盐还原酶法检测Hb注入后不同时间点血清中NO含量变化。Hb注入后,血清中NO在6h开始下降,12h明显降低,2d时相对增加但仍低于正常对照组；在3d和7d时,NO含量又明显下降,后逐渐恢复。与正常组相比,Hb组12h、24h、3d、7d和14d时NO含量均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。6、Hb注入后过氧化亚硝酸盐(ONOO-)表达变化及其细胞定位。由于过氧化亚硝酸盐(ONOO-)具有不稳定性,3-nitrotyrosine (3-NT)可作为ONOO-产生可靠的生物学标志。Westemblot检测显示,正常组及假手术组6h,几乎没有3-NT产生；Hb注入后,3-NT从6h开始增加,12h明显增加,后维持在较高水平,第3d达到峰值,后逐渐降低。Hb组各时间点3-NT水平与假手术组及正常组均有明显差异(P<0.05)。此外,免疫组化观察显示3-NT也呈现相似的表达趋势。免疫荧光观察显示3-NT主要表达在MPO阳性的中性粒细胞和ED-1阳性的小胶质细胞／巨噬细胞中。7、ELISA检测Hb注入后脑组织和血清中的ONOO-表达变化。与Westernblot检测结果一致,Elisa检测提示Hb注入后6h大鼠脑组织中的3-NT表达开始增加,后逐渐上升,在第3d达到峰值,然后逐渐下降；血清中的3-NT水平呈现相同的趋势,不同的是其在第2d达到峰值。Hb组脑组织和血清中的3-NT水平与假手术组和正常组之间均有统计学差异(P<0.05)。脑组织和血清中3-NT水平变化与大鼠脑水含量变化(r=0.689,P<0.01,与脑组织中3-NT；r=0.782,P<0.01,与血清中3-NT)和神经功能缺损改变(r=0.844,P<0.01,与脑组织中3-NT; r=0.851, P<0.01,与血清中3-NT)之间均有显著正相关性。8、通过ZO-1和三种NOS的荧光双染,进一步探究三种NOS在BBB破坏中的作用。假手术组中,表达完整、连续的ZO-1血管周围没有明显的1NOS、 iNOS和eNOS表达。在Hb组中,血管周围发现nNOS、iNOS和eNOS表达明显增加。三种NOS表达增加部位,毗邻的血管表达的ZO-1明显减少且弥散、不连续,这表明三种NOS与BBB破坏之间可能存在紧密联系。9、通过3-NT与claudin-5和ZO-1之间的荧光双染,进一步探究ONOO"在BBB破坏中的作用。假手术组中,表达完整、连续的claudin-5和ZO-1血管周围均无明显的3-NT表达。在Hb组中,血管周围发现大量密集的3-NT产生。3-NT产生明显增加的部位,毗邻的血管表达的claudin-5和ZO-1均明显减少且不连续,这提示着ONOO在BBB破坏中扮演着重要的作用。实验二1、原位明胶酶谱检测明胶酶MMP-9溶解明胶活性的细胞定位。Hb注入后24h,大部分MMP-9溶解明胶活性位于血管壁(Fibronectin, FN+)和神经元核(NeuN+)上；部分胶质细胞足突(GFAP+)与溶解明胶活性部位之间存在相互毗邻关系,特别是在血管壁处,但在胶质细胞胞体未见溶解明胶活性；同时,只有很少的溶解明胶活性位于中性粒细胞(MPO+)和小胶质细胞／巨噬细胞(ED-1+)上。这些定位结果提示,MMP-9溶解明胶活性可存在多种细胞类型中。2、FeTPPS治疗后可减少Hb诱导的ONOO产生。Westernblot检查提示：Hb注入后24h,与假手术组相比,对照组(Hb+生理盐水组)3-NT产生明显增加(P<0.01)；而给予FeTPPS治疗后,干预组(Hb±FeTPPS治疗组)3-NT产生较对照组明显减少(P<0.01)。此外,免疫组化观察显示,与假手术组相比,Hb组血肿周围损伤组织3-NT表达明显增加；而FeTPPS治疗后,3-NT表达明显降低。3、FeTPPS治疗后可减轻Hb诱导的MMP-9活化。原位明胶酶谱检查提示：假手术组仅少量的细胞和血管有较弱的溶解明胶活性,对照组即Hb注入后24h,血肿周围损伤组织溶解明胶活性明显增加(阳性的细胞和血管数明显增加,P<0.01)；而FeTPPS治疗后,干预组分解明胶活性较对照组明显减少(阳性的细胞和血管数较对照组明显减少,P<0.05)。4、FeTPPS治疗后可改善Hb介导ZO-1表达减少。Westernblot检查提示：Hb注入后24h,与假手术组相比,对照组ZO-1表达产生明显减少(P<0.01)；而FeTPPS治疗后,干预组ZO-1表达较对照组明显增加(P<0.05)。此外,免疫荧光观察显示,与假手术组相比,Hb组血肿周围损伤组织ZO-1表达明显减少且分布弥散、不连续；而FeTPPS治疗可明显改善Hb介导的ZO-1降低。5、FeTPPS治疗后可减轻Hb介导的神经功能缺损。mNSS评分显示：Hb注入后24h和3d,与假手术组相比,对照组评分均明显增加,神经功能缺损明显加重(P<0.01)；而给予FeTPPS治疗后,干预组24h评分较对照组减少但未呈现明显差异(P＝0.065),而3d时干预组评分较对照组明显减少,神经功能缺损改善明显(P<0.01)。结论：1.Hb可引起脑血管内皮细胞紧密连接蛋白claudin-5/ZO-1的表达、分布变化,从而导致BBB破坏、脑水肿形成及神经功能缺损。2.Hb可引起脑组织内三种NOS(包括nNOS、iNOS和eNOS)表达显著增加,进而产生过量的ONOO-。上调的三种NOS及伴随产生的过量的ONOO与claudin-5/ZO-1的破坏或减少有密切关系。3.Hb引起的BBB破坏和神经功能缺损可能与三种NOS上调和伴随的ONOO-合成有关,过量产生的ONOO-参与脑出血后脑水肿和神经功能缺损的发生、发展过程。4. ONOO可能是一个可靠的脑出血后判断脑损伤程度和临床预后的指标。5.ONOO清除剂FeTPPS在Hb模拟的大鼠脑出血模型中可以改善Hb诱导的BBB破坏和神经功能损。